12.3D: Análisis de ADN mediante sondas genéticas y PCR

El genotipado de aislados patógenos brinda un valioso apoyo durante las investigaciones de presuntos brotes y en el rastreo de enfermedades infecciosas.

Objetivos de aprendizaje

• Describir cómo se pueden usar sondas genéticas para detectar secuencias de nucleótidos únicas dentro del ADN o ARN o un microorganismo

Puntos Clave

• La hibridación puede identificar una especie bacteriana mediante el análisis de segmentos de su ADN.
• Las sondas genéticas son pequeños fragmentos de ADN o ARN que son complementarios a las secuencias específicas de ADN de un microbio en particular.
• Este enfoque es más útil en la detección de infecciones por microorganismos que son difíciles de cultivar.

Términos Clave

• reacción en cadena de la polimerasa: Una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra; utilizada en la toma de huellas genéticas etc.

Las sondas genéticas se basan en la detección de secuencias de nucleótidos únicas con el ADN o ARN de un microorganismo. Una vez que se encuentra tal secuencia de nucleótidos única, que puede representar una porción de un gen de virulencia o de ADN cromosómico, se aísla e inserta en un vector de clonación (plásmido), que luego se transforma en Escherichia coli para producir múltiples copias de la sonda. La secuencia se reaísla a partir de plásmidos y se marca con un isótopo o sustrato para uso diagnóstico. La hibridación de la secuencia con una secuencia complementaria de ADN o ARN, sigue a la escisión del ADN bicatenario del microorganismo en el espécimen. El uso de la tecnología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas se ha potenciado aún más con la introducción de técnicas de amplicación génica, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que la ADN polimerasa es capaz de copiar una cadena de ADN alargando cadenas complementarias de ADN que han sido iniciado a partir de un par de cebadores oligonucleotídicos estrechamente espaciados. Este enfoque ha tenido importantes aplicaciones en la detección de infecciones por microorganismos que son difíciles de cultivar (por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana), o que aún no se han cultivado con éxito (por ejemplo, el bacilo de la enfermedad de Whipple).

Figura: Mycobacterium Tuberculosis: un cultivo de Mycobacterium tuberculosis que revela la morfología colonial del organismo.

Está bien establecido que el genotipado de aislados patógenos brinda un valioso apoyo para la investigación de brotes sospechosos, la detección de transmisión insospechada, el rastreo de agentes infecciosos dentro de una comunidad y la identificación de posibles fuentes de infección para casos recién diagnosticados. A nivel nacional o internacional, la toma de huellas permite comparar cepas de diferentes áreas geográficas y rastrear el movimiento de cepas individuales. La técnica de toma de huellas requiere ADN genómico de alta calidad, que no solo es difícil de preparar sino que también requiere el cultivo del organismo, lo que resulta en un largo tiempo de respuesta. Además, la interpretación y el emparejamiento de huellas dactilares pueden ser complicados y requieren software informático sofisticado para el análisis a gran escala.

En contraste, los ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos no requieren el cultivo de los organismos, lo que permite el análisis de muestras en tiempo real. En muchos ensayos de tipificación basados en PCR, el ADN diana de interés se amplifica y marca por PCR, y los productos marcados se hibridan con una matriz de sondas de diagnóstico inmovilizadas. Este método ha sido utilizado con éxito para la detección de mutaciones en genes farmacorresistentes de Mycobacterium tuberculosis y para la identificación de especies de Mycobacterium. El espoligotipado, un ensayo de dot blot inverso que detecta la presencia de una serie de espaciadores únicos en el locus de repetición directa (DR), satisface la necesidad de un método simple y rápido para distinguir cepas del complejo de M. tuberculosis. Sin embargo, el espoligotipado tiene significativamente menos poder discriminatorio que las huellas dactilares.