3.2B: Métodos generales de tinción

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Objetivos de aprendizaje

Comparar y contrastar tinción in vitro e in vivo

La tinción es una técnica utilizada en microscopía para mejorar el contraste en una imagen microscópica. Las manchas y tintes se utilizan frecuentemente para resaltar estructuras en microbios para su visualización, a menudo con la ayuda de diferentes microscopios. Las manchas pueden usarse para definir y examinar diferentes tipos de microbios, diversas etapas de la vida celular (por ejemplo, el ciclo mitótico) e incluso orgánulos dentro de células individuales (por ejemplo, mitocondrias o cloroplastos).

La tinción in vivo es el proceso de teñido de tejido vivo; in vivo significa “en la vida” (en contraste con la tinción in vitro). Cuando una determinada célula o estructura adquiere colores contrastantes, su forma (morfología) o posición dentro de una célula o tejido se puede ver y estudiar fácilmente. El propósito habitual es revelar detalles citológicos que de otra manera no serían aparentes; sin embargo, la tinción también puede revelar dónde se están produciendo ciertos químicos o reacciones químicas específicas dentro de las células. La tinción in vitro implica colorear células o estructuras que han sido removidas de su contexto biológico. Ciertas manchas a menudo se combinan para revelar más detalles y características de los que una sola mancha podría revelar sola, y una contratinción es una mancha que aumenta la visibilidad de las células o estructuras cuando la tinción principal no es suficiente. Científicos y médicos pueden combinar la tinción con protocolos específicos para la fijación y preparación de muestras y pueden utilizar estas técnicas estándar como herramientas de diagnóstico consistentes y repetibles.

Hay una increíble cantidad de manchas que se pueden usar en una variedad de métodos diferentes. Lo que sigue a continuación son algunos aspectos comunes del proceso de preparación para la tinción in vitro.

Fijación: Esto puede consistir en varios pasos. La fijación tiene como objetivo preservar la forma de las células (en este caso, los microbios) tanto como sea posible. En ocasiones, la fijación por calor se usa para matar, adherir y alterar las células para que acepten manchas. La mayoría de los fijadores químicos generan enlaces químicos entre las proteínas y otras sustancias dentro de la muestra, aumentando su rigidez. Los fijadores comunes incluyen formaldehído, etanol, metanol y ácido pícrico.
Permeabilización: Esto implica el tratamiento de las células con (generalmente) un surfactante suave. Este tratamiento disuelve las membranas celulares, permitiendo que las moléculas de tinte más grandes ingresen al interior de la célula.
Montaje: Este paso generalmente implica unir las muestras a un portaobjetos de microscopio de vidrio para observación y análisis. En algunos casos, las células pueden cultivarse directamente en un portaobjetos. Para muestras de células sueltas, la muestra se puede aplicar directamente a un portaobjetos.

En su forma más simple, el proceso de tinción real puede implicar sumergir la muestra (antes o después de la fijación y montaje) en solución de tinte, seguido de enjuague y observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren el uso de un mordente, un compuesto químico que reacciona con la mancha para formar un precipitado coloreado insoluble. Cuando el exceso de solución de tinte se elimina por lavado, la mancha mordantada permanece. Existe una increíble variedad de manchas que se pueden usar en este paso, desde las que tiñen tipos microbianos específicos (ver la figura a continuación) hasta las que resaltan los subcompartimentos u orgánulos de una célula, como el núcleo o el retículo endoplásmico. Alternativamente, se puede emplear tinción negativa. Este es un método de tinción simple para bacterias, realizado por untar las células sobre el portaobjetos y luego aplicar nigrosina (un tinte sintético negro) o tinta india (una suspensión acuosa de partículas de carbono). Después del secado, los microorganismos pueden verse en microscopía de campo brillante, ya que las inclusiones más claras contrastan bien con el ambiente oscuro que los rodea

imagen — Figura: **Tinción de clamidia**: Las células del patógeno bacteriano clamidia (indicadas por flechas) se resaltan mediante una tinción llamada “geimsa”. ”

La microscopía viva de tinción in vivo comparte muchos de estos pasos, con la excepción de la fijación, que invariablemente mata al microbio a examinar.

Puntos Clave

La tinción in vivo, que visualiza las células que están vivas, y la tinción in vitro, que visualiza las células fijas, tienen usos importantes.
Existe una amplia gama de manchas que se pueden usar sobre microbios que pueden resaltar casi cualquier característica de una célula, incluso orgánulos dentro de una célula.
Los protocolos de tinción pueden ser complejos, pero comparten algunos pasos básicos: preparación, fijación, tinción y montaje.

Términos Clave

tensioactivo: un agente tensioactivo, o agente humectante, capaz de reducir la tensión superficial de un líquido; típicamente compuestos orgánicos que tienen una “cabeza” hidrófila y una “cola” hidrófoba
orgánulo: una estructura especializada que se encuentra dentro de las células que lleva a cabo un proceso de vida específico (por ejemplo, ribosomas, vacuolas)

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