7.12A: Tecnología de ADN recombinante

La clonación molecular permite la replicación de una secuencia específica de ADN en un microorganismo vivo.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Mostrar algunos de los métodos y usos del ADN recombinante

Claves para llevar

Puntos Clave

• Aunque se utiliza un número muy grande de organismos hospedadores y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria E. coli (Escherichia coli) y un vector de clonación plasmídica.
• E. coli y vectores plasmídicos son de uso común porque son técnicamente sofisticados, versátiles, ampliamente disponibles y ofrecen un rápido crecimiento de organismos recombinantes con un mínimo equipo.
• Los vectores modernos de clonación bacteriana (por ejemplo, pUC19) utilizan el sistema de cribado azul-blanco para distinguir colonias (clones) de células transgénicas de las que contienen el vector parental.

Términos Clave

• reacción en cadena de la polimerasa: Una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra; utilizada en la toma de huellas genéticas etc.
• clonación molecular: un conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN recombinante y dirigir su replicación dentro de organismos hospedadores.
• enzima de restricción: Endonucleasa que cataliza la escisión bicatenaria de ADN que contiene una secuencia específica.

La tecnología de ADN recombinante también conocida como clonación molecular es similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que permite la replicación de una secuencia de ADN específica. La diferencia fundamental entre los dos métodos es que la clonación molecular implica la replicación del ADN en un microorganismo vivo, mientras que la PCR replica el ADN en una solución in vitro, libre de células vivas.

En experimentos de clonación molecular estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete etapas:

1. Elección del organismo huésped y vector de clonación
2. Preparación de ADN vector
3. Preparación de ADN a clonar
4. Creación de ADN recombinante
5. Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped
6. Selección de organismos que contienen ADN recombinante
7. Cribado de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas

Aunque se utiliza un número muy grande de organismos hospedadores y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria E. coli (Escherichia coli) y un vector de clonación plasmídica. E. coli y vectores plasmídicos son de uso común porque son técnicamente sofisticados, versátiles, ampliamente disponibles y ofrecen un rápido crecimiento de organismos recombinantes con un mínimo equipo. El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño. La enzima de restricción se elige para generar una configuración en el sitio de escisión que sea compatible con la de los extremos del ADN extraño.

Típicamente, esto se hace escindiendo el ADN del vector y el ADN extraño con la misma enzima de restricción, por ejemplo EcoRI. La mayoría de los vectores modernos contienen una variedad de sitios de escisión convenientes que son únicos dentro de la molécula del vector (de modo que el vector solo se puede escindir en un solo sitio) y se localiza dentro de un gen (frecuentemente beta-galactosidasa) cuya inactivación puede usarse para distinguir recombinante de no recombinante organismos en un paso posterior en el proceso. Para mejorar la relación de organismos recombinantes a no recombinantes, el vector escindido puede tratarse con una enzima (fosfatasa alcalina) que desfosforila los extremos del vector. Las moléculas de vector con extremos desfosforilados son incapaces de replicarse, y la replicación solo puede restaurarse si se integra ADN extraño en el sitio de escisión.

Para la clonación del ADN genómico, el ADN a clonar se extrae del organismo de interés. Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan a menudo para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN (RT-PCR) antes de la clonación molecular. El ADN purificado se trata luego con una enzima de restricción para generar fragmentos con extremos capaces de unirse a los del vector. Si es necesario, se pueden añadir segmentos cortos de ADN bicatenarios (enlazadores) que contienen sitios de restricción deseados para crear estructuras finales que sean compatibles con el vector. La creación de ADN recombinante es en muchos sentidos el paso más simple del proceso de clonación molecular. El ADN preparado a partir del vector y la fuente extraña simplemente se mezclan juntos a concentraciones apropiadas y se exponen a una enzima (ADN ligasa) que une covalentemente los extremos entre sí. Esta reacción de unión a menudo se denomina ligadura. La mezcla de ADN resultante que contiene extremos unidos aleatoriamente está lista para su introducción en el organismo huésped. La mezcla de ADN, previamente manipulada in vitro, se mueve de nuevo a una célula viva, denominada organismo huésped. Los métodos utilizados para introducir ADN en las células son variados, y el nombre aplicado a esta etapa en el proceso de clonación molecular a menudo dependerá del método experimental que se elija (por ejemplo, transformación, transducción, transfección, electroporación).

Cuando los microorganismos son capaces de captar y replicar ADN de su entorno local, el proceso se denomina transformación, y se dice que las células que se encuentran en un estado fisiológico tal que pueden tomar ADN son competentes. Cuando se utilizan células bacterianas como organismos hospedadores, el marcador seleccionable suele ser un gen que confiere resistencia a un antibiótico que de otro modo mataría las células, típicamente ampicilina. Las células que albergan el vector sobrevivirán cuando se expongan al antibiótico, mientras que aquellas que no hayan logrado captar secuencias vectoriales morirán. Los vectores modernos de clonación bacteriana (por ejemplo, pUC19) utilizan el sistema de cribado azul-blanco para distinguir colonias (clones) de células transgénicas de las que contienen el vector parental.

En estos vectores, el ADN extraño se inserta en una secuencia que codifica una parte esencial de la beta-galactosidasa, enzima cuya actividad da como resultado la formación de una colonia de color azul sobre el medio de cultivo que se utiliza para este trabajo. La inserción del ADN extraño en la secuencia codificante de la beta-galactosidasa inhabilita la función de la enzima, de manera que las colonias que contienen plásmidos recombinantes permanecen incoloras (blancas). Por lo tanto, los clones recombinantes son fácilmente identificados.

Figura: Pantalla azul blanco: El cribado azul-blanco es una técnica de cribado que permite la detección de ligaciones exitosas en la clonación génica basada en vectores. El ADN de interés se liga en un vector. Luego, el vector se transforma en célula competente (bacteria). Las células competentes se cultivan en presencia de X-gal. Si la ligadura fue exitosa, la colonia bacteriana será blanca; si no, la colonia será azul. Esta técnica permite la detección rápida y fácil de una ligadura exitosa.