7.12E: Técnicas Básicas para Manipular Material Genético (ADN y ARN)

Las técnicas básicas utilizadas en la manipulación de materiales genéticos incluyen extracción, electroforesis en gel, PCR y métodos de transferencia.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Distinguir entre las técnicas básicas utilizadas para manipular ADN y ARN

Claves para llevar

Puntos Clave

• El primer paso para estudiar o trabajar con ácidos nucleicos incluye el aislamiento o extracción de ADN o ARN de las células.
• La electroforesis en gel depende de los iones cargados negativamente presentes en los ácidos nucleicos a pH neutro o básico para separar las moléculas en función del tamaño.
• Las regiones específicas del ADN pueden amplificarse mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para su posterior análisis.
• La transferencia Southern implica la transferencia de ADN a una membrana de nylon, mientras que la transferencia northern es la transferencia de ARN a una membrana de nylon; estas técnicas permiten sondear muestras para detectar la presencia de ciertas secuencias.

Términos Clave

• desnaturalización: el cambio de estructura de plegamiento de una proteína (y por lo tanto de las propiedades físicas) causado por el calentamiento, cambios en el pH o exposición a ciertos productos químicos
• electroforesis: un método para la separación y análisis de moléculas grandes, como proteínas o ácidos nucleicos, migrando una solución coloidal de ellas a través de un gel bajo la influencia de un campo eléctrico
• reacción en cadena de la polimerasa: una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra

Técnicas Básicas para Manipular Material Genético (ADN y ARN)

Para comprender las técnicas básicas utilizadas para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas hechas de nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada) unidos por enlaces fosfodiéster. Los grupos fosfato en estas moléculas tienen cada uno una carga neta negativa. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo se llama genoma. El ADN tiene dos cadenas complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas. Las dos cadenas se pueden separar por exposición a altas temperaturas (desnaturalización del ADN) y se pueden volver a hibridar por enfriamiento. El ADN puede ser replicado por la enzima ADN polimerasa. A diferencia del ADN, que se encuentra en el núcleo de las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El tipo de ARN más común que se analiza es el ARN mensajero (ARNm) porque representa los genes codificantes de proteínas que se expresan activamente.

Extracción de ADN y ARN

Para estudiar o manipular ácidos nucleicos, primero se debe aislar o extraer el ADN o ARN de las células. Esto se puede hacer a través de diversas técnicas. La mayoría de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos implican pasos para romper la célula y usar reacciones enzimáticas para destruir todas las macromoléculas que no se desean (como la degradación de moléculas no deseadas y la separación de la muestra de ADN). Las células se rompen usando un tampón de lisis (una solución que es principalmente un detergente); lisis significa “dividir”. Estas enzimas rompen las moléculas lipídicas en las membranas de la célula y el núcleo. Las macromoléculas se inactivan usando enzimas como proteasas que descomponen las proteínas y ribonucleasas (RNasas) que descomponen el ARN. Después, el ADN se precipita usando alcohol. El ADN genómico humano suele ser visible como una masa gelatinosa y blanca. Las muestras se pueden almacenar a —80°C durante años.

Figura: Extracción de ADN: Este diagrama muestra el método básico utilizado para la extracción de ADN.

El análisis de ARN se realiza para estudiar los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las RNasas están comúnmente presentes en la naturaleza y son muy difíciles de inactivar. Similar al ADN, la extracción de ARN implica el uso de diversos tampones y enzimas para inactivar macromoléculas y preservar el ARN.

Electroforesis en Gel

Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o básico en un ambiente acuoso, pueden ser movilizados por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar moléculas en base al tamaño usando esta carga y puede separarse como cromosomas completos o fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura cerca del electrodo negativo de una matriz de gel poroso y se estiran hacia el electrodo positivo en el extremo opuesto del gel. Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros en el gel más rápido que las moléculas más grandes; esta diferencia en la velocidad de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Hay muestras estándar de peso molecular que se pueden ejecutar junto con las moléculas para proporcionar una comparación de tamaños. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel se pueden observar usando diversos colorantes fluorescentes o coloreados. Distintos fragmentos de ácido nucleico aparecen como bandas a distancias específicas de la parte superior del gel (el extremo negativo del electrodo) en función de su tamaño.

Figura: Electroforesis en gel: Se muestran fragmentos de ADN de siete muestras ejecutadas en un gel, teñidas con un tinte fluorescente y vistas bajo luz UV.

Amplificación de fragmentos de ácido nucleico por reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para amplificar regiones específicas del ADN para su posterior análisis. La PCR se utiliza para muchos propósitos en laboratorios, como la clonación de fragmentos génicos para analizar enfermedades genéticas, la identificación de ADN extraño contaminante en una muestra y la amplificación del ADN para la secuenciación. Las aplicaciones más prácticas incluyen la determinación de la paternidad y la detección de enfermedades genéticas.

Figura: Amplificación por PCR: La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, se utiliza para amplificar una secuencia específica de ADN. Los cebadores, fragmentos cortos de ADN complementarios a cada extremo de la secuencia diana, se combinan con ADN genómico, polimerasa Taq y desoxinucleótidos. La polimerasa Taq es una ADN polimerasa aislada de la bacteria termoestable Thermus aquaticus que es capaz de soportar las altas temperaturas utilizadas en la PCR. Thermus aquaticus crece en la Cuenca del Géiser Inferior del Parque Nacional Yellowstone. La PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es similar a la PCR, pero el ADNc se elabora a partir de un molde de ARN antes de que comience la PCR.

Los fragmentos de ADN también pueden amplificarse a partir de un molde de ARN en un proceso llamado PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). El primer paso es recrear la cadena molde de ADN original (llamada ADNc) aplicando nucleótidos de ADN al ARNm. Este proceso se llama transcripción inversa. Esto requiere la presencia de una enzima llamada transcriptasa inversa. Después de hacer el ADNc, se puede usar PCR regular para amplificarlo.

Hibridación, Southern Blotting y Northern Blotting

Las muestras de ácido nucleico, como los extractos de ADN y ARN genómicos fragmentados, pueden sondearse para detectar la presencia de ciertas secuencias. Los fragmentos cortos de ADN llamados sondas están diseñados y marcados con tintes radiactivos o fluorescentes para ayudar a la detección. La electroforesis en gel separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño. Los fragmentos en el gel se transfieren luego a una membrana de nylon en un procedimiento llamado blotting. Los fragmentos de ácido nucleico que se unen a la superficie de la membrana se pueden sondear con secuencias de sonda específicas marcadas radiactivamente o fluorescentemente. Cuando el ADN se transfiere a una membrana de nylon, la técnica se llama Southern blotting; cuando el ARN se transfiere a una membrana de nylon, se llama Northern Blot. Las manchas Southern se utilizan para detectar la presencia de ciertas secuencias de ADN en un genoma dado, y las manchas Northern se utilizan para detectar la expresión génica.

Figura: Técnicas de transferencia: Se utiliza la transferencia Southern para encontrar una secuencia particular en una muestra de ADN. Los fragmentos de ADN se separan en un gel, se transfieren a una membrana de nylon y se incuban con una sonda de ADN complementaria a la secuencia de interés. La transferencia Northern es similar a la transferencia Southern, pero el ARN se ejecuta en el gel en lugar de ADN. En la transferencia Western, las proteínas se ejecutan en un gel y se detectan usando anticuerpos.