7.12G: Plásmidos como vectores de clonación

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Los plásmidos pueden ser utilizados como vectores de clonación, permitiendo la inserción de ADN exógeno en una diana bacteriana.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Ilustrar cómo los plásmidos se pueden usar como vectores de clonación

Claves para llevar

Puntos Clave

Todos los vectores modificados por ingeniería genética tienen un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable.
Los vectores de expresión (construcciones de expresión) expresan el transgén en la célula diana, y tienen una secuencia promotora que impulsa la expresión del transgén.
La transcripción es necesaria para que un plásmido funcione, sin las secuencias adecuadas para transcribir partes de un plásmido no se expresará ni se mantendrá en las células hospedadoras.
Los vectores pueden tener muchas secuencias adicionales que se pueden usar para aplicaciones posteriores: purificación de proteínas codificadas por el plásmido y que expresan proteínas dirigidas a ser exportadas o a un cierto compartimento de la célula.

Términos Clave

Secuencia de Kozak: una secuencia que se produce en ARNm eucariota y tiene el consenso (gcc) GcCRCCaugg. La secuencia consenso de Kozak juega un papel importante en el inicio del proceso de traducción. La secuencia lleva el nombre de la persona que la sacó a la fama, Marilyn Kozak.
transcripción: La síntesis de ARN bajo la dirección del ADN.
poliadenilación: La formación de un poliadenilato, especialmente la de un ácido nucleico

Vectores

En biología molecular, un vector es una molécula de ADN utilizada como vehículo para transferir material genético extraño a otra célula. Los cuatro tipos principales de vectores son plásmidos, vectores virales, cósmidos y cromosomas artificiales. Todos los vectores modificados por ingeniería genética tienen un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable. El vector en sí es generalmente una secuencia de ADN que consiste en un inserto (transgén) y una secuencia más grande, que sirve como la “cadena principal” del vector. El propósito de un vector que transfiere información genética a otra célula es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula diana. Los vectores llamados vectores de expresión (constructos de expresión) expresan el transgén en la célula diana, y generalmente tienen una secuencia promotora que impulsa la expresión del transgén.

Plásmidos

Los plásmidos son secuencias de ADN bicatenarias, generalmente circulares, capaces de replicarse automáticamente en una célula hospedadora. Los vectores plasmídicos consisten mínimamente en el inserto del transgén y un origen de replicación, lo que permite la replicación semi-independiente del plásmido en el huésped. Los plásmidos modernos generalmente tienen muchas más características, notablemente un “sitio de clonación múltiple”, con voladizos de nucleótidos para la inserción de un inserto, y múltiples sitios de consenso de enzimas de restricción a ambos lados del inserto. Los plásmidos pueden ser conjugativos/transmisibles o no conjugativos. Los plásmidos conjugativos median la transferencia de ADN a través de la conjugación y por lo tanto se propagan rápidamente entre las células bacterianas de una población Los plásmidos no conjugativos no median en el ADN a través de la conjugación.

imagen — Figura: **Vector de clonación bacteriana**: El plásmido pGEX-3X es un vector de clonación popular. Los diversos elementos del plásmido están etiquetados.

Transcripción

La transcripción es un componente necesario en todos los vectores. El propósito de un vector es multiplicar la inserción, aunque los vectores de expresión también impulsan la traducción del inserto multiplicado. Incluso la expresión estable se determina por transcripción estable, que depende de promotores en el vector. Sin embargo, los vectores de expresión tienen dos patrones de expresión: constitutivo (expresión consistente) o inducible (expresión solo bajo ciertas condiciones o sustancias químicas). La expresión se basa en diferentes actividades promotoras, no actividades postranscripcionales, lo que significa que estos dos tipos diferentes de vectores de expresión dependen de diferentes tipos de promotores. Los vectores de expresión requieren la traducción del inserto del vector, requiriendo así más componentes que los vectores de solo transcripción más simples.

Los vectores de expresión requieren secuencias que codifican para:

Una cola de poliadenilación al final del pre-ARNm transcrito: Esto protege al ARNm de las exonucleasas y asegura la terminación transcripcional y traduccional y estabiliza la producción de ARNm.
Longitud mínima de UTR: las UTR contienen características específicas que pueden impedir la transcripción o traducción, por lo que las UTR más cortas se codifican en vectores de expresión óptimos.
Secuencia de Kozak: un vector debe codificar una secuencia de Kozak en el ARNm, que ensambla el ribosoma para la traducción del ARNm.

Las condiciones anteriores son necesarias para vectores de expresión en eucariotas, no procariotas.

Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales además del inserto del transgén y una cadena principal:

Promotor: un componente necesario para todos los vectores, utilizado para impulsar la transcripción del transgén del vector.
Marcadores genéticos: Los marcadores genéticos para vectores virales permiten confirmar que el vector se ha integrado con el ADN genómico del huésped.
Resistencia a antibióticos: Los vectores con resistencia antibiótica permiten la supervivencia de las células que han absorbido el vector en medios de crecimiento que contienen antibióticos a través de la selección de antibióticos.
Epítopo: Un vector que contiene una secuencia para un epítopo específico que se incorpora a la proteína expresada. Permite la identificación de anticuerpos de células que expresan la proteína diana.
Genes indicadores: Algunos vectores pueden contener un gen informador que permita la identificación del plásmido que contiene la secuencia de ADN insertada. Un ejemplo es LacZ-α que codifica para el fragmento N-terminal de β-galactosidasa, una enzima que digiere galactosa.
Secuencia dirigida: Los vectores de expresión pueden incluir la codificación de una secuencia diana en la proteína terminada que dirige la proteína expresada a un orgánulo específico en la célula o ubicación específica tal como el espacio periplásmico de las bacterias.
Etiquetas de purificación de proteínas: Algunos vectores de expresión incluyen proteínas o secuencias peptídicas que permiten una purificación más fácil de la proteína expresada. Los ejemplos incluyen etiqueta de polihistidina, glutatión-S-transferasa y proteína de unión a maltosa. Algunas de estas etiquetas también pueden permitir una mayor solubilidad de la proteína diana. La proteína diana se fusiona con la etiqueta de proteína, pero un sitio de escisión de proteasa colocado en la región enlazadora polipeptídica entre la proteína y la etiqueta permite que la etiqueta se elimine más tarde.

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