7.14B: Obtención de ADN

Al clonar ADN genómico, el ADN a clonar se extrae del organismo de interés.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Explicar los métodos de obtención de ADN para experimentos de clonación molecular y el proceso de creación de una molécula de ADN recombinante

Principales conclusiones

Puntos Clave

• El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño.
• El ADN para experimentos de clonación también se puede obtener a partir de ARN usando transcriptasa inversa (clonación complementaria de ADN o ADNc), o en forma de ADN sintético (síntesis génica artificial).
• La creación de ADN recombinante es en muchos sentidos el paso más simple del proceso de clonación molecular.

Términos Clave

• ADN: Un biopolímero de ácidos desoxirribonucleicos (un tipo de ácido nucleico) que tiene cuatro grupos químicos diferentes, llamados bases: adenina, guanina, citosina y timina.
• clonación: La producción de un embrión clonado trasplantando el núcleo de una célula somática a un óvulo.
• vector de clonación: Un vector de clonación es un pequeño trozo de ADN, tomado de un virus, un plásmido o la célula de un organismo superior, en el que se puede insertar un fragmento de ADN extraño.

La clonación molecular es un conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN recombinante y dirigir su replicación dentro de organismos hospedadores. La palabra clonación en este contexto se refiere al hecho de que el método implica la replicación de una sola molécula de ADN partiendo de una sola célula viva para generar una gran población de células que contienen moléculas de ADN idénticas. La clonación molecular generalmente utiliza secuencias de ADN de dos organismos diferentes: la especie que es la fuente del ADN a clonar, y la especie que servirá como huésped vivo para la replicación del ADN recombinante.

Para la clonación del ADN genómico, el ADN a clonar se extrae del organismo de interés. Prácticamente se puede usar cualquier fuente de tejido (incluso tejidos de animales extintos) siempre y cuando el ADN no se degrade extensamente. Luego se purifica el ADN mediante métodos simples para eliminar proteínas contaminantes (extracción con fenol), ARN (ribonucleasa) y moléculas más pequeñas (precipitación y/o cromatografía). Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan a menudo para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN (mediante un proceso conocido como transcripción inversa o RT-PCR) antes de la clonación molecular usando cebadores o secuencias cortas de ADN específicas para la región de interés. El ADN para experimentos de clonación también se puede obtener a partir de ARN usando transcriptasa inversa (ADN complementario o clonación de ADNc), o en forma de ADN sintético (síntesis génica artificial). La clonación de ADNc se usa generalmente para obtener clones representativos de la población de ARNm de las células de interés, mientras que el ADN sintético se utiliza para obtener cualquier secuencia precisa definida por el diseñador.

Figura: Las etapas de la PCR: Esto ilustra una reacción de PCR para demostrar cómo la amplificación conduce al crecimiento exponencial de un producto corto flanqueado por los cebadores. 1. Desdesnaturalizante a 96°C. 2. Recocido a 68°C. 3. Elongación a 72°C. El primer ciclo está completo. Las dos cadenas de ADN resultantes conforman el ADN molde para el siguiente ciclo, duplicando así la cantidad de ADN duplicado para cada nuevo ciclo.

Aunque se utiliza un número muy grande de organismos hospedadores y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria E. coli (Escherichia coli) y un vector de clonación plasmídica. E. coli y vectores plasmídicos son de uso común porque son técnicamente sofisticados, versátiles, ampliamente disponibles y ofrecen un rápido crecimiento de organismos recombinantes con un mínimo equipo. Si el ADN que se va a clonar es excepcionalmente grande (cientos de miles a millones de pares de bases), entonces a menudo se elige un cromosoma artificial bacteriano o un vector de cromosoma artificial de levadura.

El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño. La enzima de restricción se elige para generar una configuración en el sitio de escisión que sea compatible con la de los extremos del ADN extraño. Típicamente, esto se hace escindiendo el ADN del vector y el ADN extraño con la misma enzima de restricción. La mayoría de los vectores modernos contienen una variedad de sitios de escisión convenientes que son únicos dentro de la molécula del vector (de modo que el vector solo se puede escindir en un solo sitio) y no se localizan dentro del gen de interés a clonar.

La creación de ADN recombinante es en muchos sentidos el paso más simple del proceso de clonación molecular. El ADN preparado a partir del vector y la fuente foránea se tratan con enzimas de restricción para generar fragmentos con extremos capaces de unirse a los del vector y simplemente se mezclan juntos en concentraciones apropiadas y se exponen a una enzima (ADN ligasa) que une covalentemente los extremos entre sí. Esta reacción de unión a menudo se denomina ligadura. La mezcla de ADN resultante que contiene extremos unidos aleatoriamente está lista para su introducción en el organismo huésped para su amplificación (un proceso conocido como transformación). En el cultivo celular de mamíferos, el proceso análogo de introducir ADN en las células se conoce comúnmente como transfección. Tanto la transformación como la transfección suelen requerir la preparación de las células a través de un régimen de crecimiento especial y un proceso de tratamiento químico que variará con las especies específicas y los tipos de células que se utilicen. Cualquiera que sea el método que se utilice, la introducción de ADN recombinante en el organismo huésped elegido suele ser un proceso de baja eficiencia; es decir, solo una pequeña fracción de las células realmente absorberá ADN. Cuando se utilizan células bacterianas como organismos hospedadores, el marcador seleccionable suele ser un gen que confiere resistencia a un antibiótico, típicamente ampicilina, que de otro modo mataría a las células. Las células que albergan el vector de clonación sobrevivirán cuando se expongan al antibiótico, mientras que las que no hayan logrado captar el vector de clonación morirán. Por lo tanto, el primero puede amplificarse y cribarse para detectar la presencia del gen de interés en el vector de clonación mediante análisis de digestión por restricción.