7.16A: Detección de microorganismos no cultivados

Usando metagenómica, los constituyentes microbianos del mundo pueden identificarse cultivando cada especie individual.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Reconocer los métodos utilizados para detectar microorganismos no cultivados

Claves para llevar

Puntos Clave

• Muchos organismos que pueden causar enfermedades no son cultivables, por lo que no se puede obtener un cultivo unicelular.
• Los estudios iniciales de la fauna microbiana mostraron que son más diversos de lo esperado y contenían muchos microbios que no eran cultivables.
• Los avances en las técnicas de biología molecular permiten la secuenciación de todos o al menos muchos de los genomas de microbios que se encuentran en una muestra.

Términos Clave

• secuenciación de escopeta: técnica de secuenciación de ADN en la que un gran número de pequeños fragmentos de una larga cadena de ADN se generan al azar, se secuencian y se vuelven a ensamblar para formar una secuencia de la cadena original.
• Culturable: Capaz de ser cultivado (cultivado en un ambiente adecuado).
• secuenciación de alto rendimiento: Tecnologías que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias a la vez.

La identificación de bacterias en el laboratorio es particularmente relevante en medicina, donde el tratamiento correcto es determinado por las especies bacterianas causantes de una infección. En consecuencia, la necesidad de identificar patógenos humanos fue un impulso importante para el desarrollo de técnicas de identificación de bacterias.

Los primeros estudios han demostrado que la vida microbiana que nos rodea en el aire, el mar y el suelo es muy diversa y solo se conoce una pequeña fracción de las especies. Una limitación de identificación de patógenos humanos o secuenciación convencional comienza con un cultivo de células idénticas como fuente de ADN. Sin embargo, estudios metagenómicos tempranos revelaron que probablemente hay grandes grupos de microorganismos en muchos ambientes que no pueden ser cultivados y por lo tanto no pueden ser secuenciados. Estos primeros estudios se centraron en secuencias de ARN ribosómico 16S que son relativamente cortas, a menudo conservadas dentro de una especie y generalmente diferentes entre especies. Se han encontrado muchas secuencias de ARNr 16S que no pertenecen a ninguna especie cultivada conocida, lo que indica que existen numerosos organismos no aislados por ahí. Estos estudios de genes de ARN ribosómico (ARNr) tomados directamente del ambiente revelaron que los métodos basados en el cultivo encuentran menos del 1% de las especies bacterianas y arqueales en una muestra.

Figura: Secuenciación ambiental de escopeta (ESS): (A) muestreo del hábitat; (B) partículas filtrantes, típicamente por tamaño; (C) Lisis y extracción de ADN; (D) clonación y construcción de bibliotecas; (E) secuenciación de los clones; (F) ensamblaje de secuencias en cóntigos y andamios

El descubrimiento de dicha diversidad condujo al campo de la metagenómica, que es el estudio de los metagenomas, material genético recuperado directamente de muestras ambientales. En lugar de cultivar un microbio, este enfoque toma una muestra e identifica las diferentes especies en ella secuenciando todas las especies simultáneamente. Sin embargo, la recuperación de secuencias de ADN de más de unos pocos miles de pares de bases a partir de muestras ambientales fue muy difícil hasta los recientes avances en técnicas de biología molecular. Más específicamente, la construcción de bibliotecas en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) proporcionó mejores vectores para la clonación molecular.

Los avances en bioinformática, los refinamientos de la amplificación del ADN y la proliferación del poder computacional han ayudado enormemente al análisis de secuencias de ADN recuperadas de muestras ambientales. Estos avances han permitido la adaptación de la secuenciación de escopeta a muestras metagenómicas. El enfoque, utilizado para secuenciar muchos microorganismos cultivados y el genoma humano, corta aleatoriamente el ADN, secuencia muchas secuencias cortas y las reconstruye en una secuencia consenso.

La secuenciación de escopeta y las pantallas de bibliotecas de clones revelan genes presentes en muestras ambientales. Esto puede ser útil para comprender la ecología de una comunidad, particularmente si se comparan múltiples muestras entre sí. Esto fue seguido por una secuenciación de alto rendimiento que realizó el mismo proceso que la secuenciación de escopeta pero a una escala mucho mayor en términos de la cantidad de ADN que se pudo secuenciar a partir de una muestra. Esto proporciona información tanto sobre qué organismos están presentes como qué procesos metabólicos son posibles en la comunidad. Utilizando la metagenómica y la secuenciación resultante de microbios no cultivados, la metagenómica tiene el potencial de avanzar en el conocimiento en una amplia variedad de campos. También se puede aplicar para resolver desafíos prácticos en medicina, ingeniería, agricultura y sustentabilidad.