15.2: Instrumentos para la Medición de Fluorescencia y Fosforescencia

Instrumentación

La instrumentación básica para monitorear la fluorescencia y la fosforescencia, una fuente de radiación, un medio para seleccionar una banda estrecha de radiación y un detector, son las mismas que las de la espectroscopia de absorción. Sin embargo, las demandas únicas de fluorescencia y fosforescencia requieren algunas modificaciones en los diseños de instrumentos discutidos en capítulos anteriores: el fotómetro de filtro, el espectrofotómetro de un solo haz, el espectrofotómetro de doble haz y el espectrómetro de matriz de diodos. La diferencia más importante es que el detector no se puede colocar directamente frente a la fuente. La figura\(\PageIndex{1}\) muestra por qué este es el caso. Si colocamos el detector a lo largo del eje de la fuente, recibe tanto la radiación de fuente transmitida, P _T, como la radiación fluorescente, I _f, o fosforescente, I _p, radiación. En cambio, rotamos al director y lo colocamos a los 90 ^o a la fuente.

Figura\(\PageIndex{1}\). Diagrama esquemático que muestra la orientación de la fuente y el detector al medir la fluorescencia y la fosforescencia. Contraste esto con la Figura 13.4.2, que muestra la orientación para la espectroscopia de absorción.

Instrumentos para Medir Fluorescencia

La figura\(\PageIndex{2}\) muestra el diseño básico de un instrumento para medir la fluorescencia, que incluye dos selectores de longitud de onda, uno para seleccionar la longitud de onda de excitación de la fuente y otro para seleccionar la longitud de onda de emisión del analito. En un fluorómetro las longitudes de onda de excitación y emisión se seleccionan usando filtros de absorción o interferencia. La fuente de excitación para un fluorómetro suele ser una lámpara de vapor de Hg de baja presión que proporciona líneas de emisión intensas distribuidas por toda la región ultravioleta y visible. Cuando se utiliza un monocromador para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión, el instrumento se denomina espectrofluorómetro. Con un monocromador la fuente de excitación suele ser una lámpara de arco Xe de alta presión, que tiene un espectro de emisión continua. Cualquiera de los dos diseños instrumentales es apropiado para el trabajo cuantitativo, aunque solo un espectrofluorómetro puede registrar un espectro de excitación o emisión.

Una lámpara de vapor de Hg tiene líneas de emisión a 254, 312, 365, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm.

Figura\(\PageIndex{2}\). Diagrama esquemático para medir la fluorescencia que muestra la colocación de los selectores de longitud de onda para excitación y emisión. Cuando se usa un filtro el instrumento se llama fluorómetro y cuando se usa un monocromador el instrumento se llama espectrofluorómetro.

Las células de muestra para fluorescencia molecular son similares a las de absorción molecular. La detección remota usando una sonda de fibra óptica es posible usar con un fluorómetro o un espectrofluorómetro. Un analito que es fluorescente es monitoreado directamente. Para un analito que no es fluorescente, se incorpora una molécula sonda fluorescente adecuada en la punta de la sonda de fibra óptica. La reacción del analito con la molécula sonda conduce a un aumento o disminución de la fluorescencia.

Instrumentos para la Medición de Fosforescencia

Un instrumento para la fosforescencia molecular debe discriminar entre fosforescencia y fluorescencia. Debido a que la vida útil de la fluorescencia es más corta que la de la fosforescencia, la discriminación se logra incorporando un retraso entre la excitación de la muestra y la medición de la emisión fosforescente. La figura\(\PageIndex{3}\) muestra cómo dos choppers fuera de fase nos permiten bloquear la emisión fluorescente para que no llegue al detector cuando la muestra está siendo excitada y evitar que la radiación fuente cause fluorescencia cuando estamos midiendo la emisión fosforescente.

Figura\(\PageIndex{3}\). Diagrama esquemático que muestra cómo se utilizan los choppers para evitar que la emisión fluorescente interfiera con la medición de la emisión fosforescente.

Debido a que la fosforescencia es un proceso tan lento, debemos evitar que el estado excitado se relaje por conversión externa. Una forma de lograr esto es disolviendo la muestra en un disolvente orgánico adecuado, generalmente una mezcla de etanol, isopentano y dietil eter. La solución resultante se congela a temperaturas Líquido-N ₂ para formar un sólido ópticamente transparente. La matriz sólida minimiza la conversión externa debido a colisiones entre el analito y el disolvente. La conversión externa también se minimiza mediante la inmovilización de la muestra sobre un sustrato sólido, haciendo posibles mediciones de temperatura ambiente. Un enfoque es colocar una gota de una solución que contiene el analito en un pequeño disco de papel de filtro. Después de secar la muestra bajo una lámpara de calor, la muestra se coloca en el espectrofluorómetro para su análisis. Otros sustratos sólidos incluyen gel de sílice, alúmina, acetato de sodio y sacarosa. Este enfoque es particularmente útil para el análisis de placas de cromatografía en capa fina.