3.1: Ca²+-Proteínas de unión en microorganismos- La búsqueda de una calmodulina procariota

Dado que los iones Ca ²⁺ juegan evidentemente un papel importante en la regulación de una variedad de respuestas celulares en animales y organismos superiores, uno puede preguntarse si este uso de Ca ²⁺ es un descubrimiento reciente de la naturaleza, o si fue inventado temprano en la evolución. Ahora parece bien establecido que la proteína “Ca ²⁺ - receptor” intracelular clave calmodulina (CaM; ver Sección V.A) está presente en todas las células eucariotas. Incluso en un eucariota unicelular como levadura común (Saccharomyces cerevisiae), el Ca ²⁺ tiene un papel regulador importante, y recientemente se aisló CaM de levadura, así como el gen único que lo codifica. ¹⁶⁰

La secuencia de aminoácidos de la CaM de levadura (147 a.a.; M _r = 16.1 kDa) es 60 por ciento idéntica a las secuencias de todas las demás CAM conocidas. De hecho, si se permiten reemplazos conservadores de aminoácidos generalmente aceptados, la homología aumenta a 80 por ciento o más, siendo las porciones más altamente conservadas los cuatro supuestos sitios de unión a Ca ²⁺. Los sitios I y III coinciden muy bien con la secuencia de prueba manual EF (ver Figura 3.24); en el sitio a His ocurre después del ligando “z” - en lugar del arquetípico Gly; y en el sitio IV no hay aminoácido entre los residuos que generalmente componen los ligandos “x” e “y”. Aún no se conoce el efecto de estas alteraciones sobre la afinidad Ca ²⁺ de CaM de levadura.

Que CaM es esencial para el crecimiento de las células de levadura se demostró por deleción o alteración del gen. Esto constituye, de hecho, la primera demostración en cualquier organismo de que CaM es una proteína esencial. (¡Las deleciones de genes en mamíferos son procedimientos de investigación éticamente cuestionables!)

En las células procariotas bioquímicamente menos sofiscadas (que las eucariotas), el papel regulador del Ca ²⁺ no está bien establecido. Lo que se sabe es que el calcio se acumula masivamente durante la esporulación en muchas bacterias, por ejemplo, en cepas de Bacillus, Streptomyces y Myxococcus. En Myxococcus xanthus una proteína específica del desarrollo llamada proteína S se ensambla en la superficie de las mixosporas en presencia de Ca ²⁺. La secuencia de ADN del gen que codifica esta proteína ha sido descifrada. ¹⁶¹ La secuencia primaria de la proteína S (175 a.a., M _r = 19.2 kDa) resulta muy parecida a la CaM de mamíferos. Tiene cuatro regiones internamente homólogas con supuestos sitios Ca ²⁺. Al menos dos de estos son en parte similares a la típica mano EF, pero inusualmente hay muchas más prolinas en la proteína de M. xanthus que en la CaM bovina (12 frente a 2); por lo que es cuestionable si la proteína bacteriana realmente tiene la estructura repetida hélice-bucle-hélice que se encuentra en la CaM de mamíferos . ¹⁶²

Un candidato para una CaM procariota fue reportado por Leadlay et al. ¹⁶³ en Streptomyces erythreaus, la bacteria que produce el conocido antibiótico “eritromicina”. La secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a Ca ²⁺ de bajo peso molecular, determinada a partir del gen que la codifica, reveló una alta homología con CaM de mamíferos. La proteína está compuesta por 177 aminoácidos (M _r = 20.1 kDa), y tiene cuatro regiones que se predice que tienen la estructura secundaria hélice-bucle-hélice típica de las proteínas de mano EF. Las secuencias alineadas de los 12 residuos en cada uno de los cuatro bucles potenciales de unión a calcio en la proteína de S. erythreaus se comparan con las de calmodulina humana en la Tabla 3.6.

Tabla 3.6 - Secuencias alineadas de la mano EF para las calmodulinas procariotas y humanas

Ligandos	1		3		5		7		9			12
Proteína I de S. erythraeus	D	F	D	G	N	G	A	L	E	R	A	D
Proteína II de S. erythraeus	G	V	G	S	D	G	S	L	T	E	E	Q
Proteína III de S. erythraeus	D	K	N	A	D	G	Q	I	N	A	D	E
Proteína IV de S. erythraeus	D	T	N	G	N	G	E	L	S	L	D	E
Calmodulina humana I	D	K	D	G	D	G	T	I	T	T	K	E
Calmodulina humana II	D	A	D	G	N	G	T	I	D	F	P	E
Calmodulina humana III	D	K	D	G	N	G	Y	I	S	A	A	E
Calmodulina IV humana	D	I	D	G	D	G	Q	V	N	Y	E	E

El patrón de residuos en la proteína de S. erythraeus es típico de una mano EF al menos en los sitios I, III y IV. El sitio II es inusual en tener Gly en ambas posiciones 1 y 3. Los estudios de RMN de ¹¹³ Cd muestran que la proteína bacteriana se une fuertemente a tres iones metálicos (K 10 ⁵ M ^-1) con desplazamientos químicos cercanos a los esperados para las manos EF, y los estudios de RMN ^1H muestran que sufre un cambio conformacional dependiente de Ca ²⁺. ¹⁶⁴

Si bien la proteína de S. erythraeus tiene una homología con CaM eucariota, se ha señalado que la proteína tiene una homología aún mayor con un grupo de proteínas de unión a Ca ²⁺ sarcoplásmicas eucariotas ¹⁶⁵ (ver Sección V.D). La búsqueda de un análogo de CaM procariota continúa, y la perspectiva de éxito se ha mejorado después de informes recientes de un polipéptido 21-amino-ácido-Iong de una proteína de choque térmico de E. coli ¹⁶⁶ que muestra las características estructurales típicas de los dominios de unión a CAM en otros eucariotas proteínas. ¹⁶⁷