5.7: Oxigenasas

Antecedentes

Las enzimas oxigenasa catalizan reacciones de dioxígeno con sustratos orgánicos en los que los átomos de oxígeno del dioxígeno se incorporan al producto oxidado final. ^2-4 Estas enzimas se pueden dividir en dioxigenasas, que dirigen tanto átomos de oxígeno hacia el producto (Reacción 5.53), como monooxigenasas, donde un átomo de oxígeno del dioxígeno se encuentra en el producto y el otro se ha reducido a agua (Reacción 5.54):

\[Dioxygenase:\; substrate + \;^{*}O_{2} \rightarrow substrate(^{*}O)_{2} \tag{5.53}\]

\[Monoxygenase:\; substrate + \;^{*}O_{2} + 2 H^{+} + 2e^{-} \rightarrow substrate(^{*}O) + H_{2}\;^{*}O \tag{5.54}\]

Dioxigenasas

Se conocen enzimas dioxigenasas que contienen hierro hemo, hierro no hemo, cobre o manganeso. ^66,67 Los sustratos cuyas oxigenaciones son catalizadas por estas enzimas son muy diversos, al igual que los sitios de unión a metales; por lo que probablemente varios mecanismos, posiblemente no relacionados, operan en estos diferentes sistemas, para muchas de estas enzimas, aún no hay mucha información mecanicista detallada. Sin embargo, algunas de las dioxigenasas intradiol catecol aisladas de fuentes bacterianas han sido estudiadas con gran detalle, y se dispone de información tanto estructural como mecanicista. ^66,67 Estos son los sistemas que aquí se describirán.

1. Intradiol Catecol Dioxigenasas

El papel de estas enzimas que no contienen hierro hemo es catalizar la degradación de derivados de catecol para dar ácidos mucónicos (Reacción 5.55, por ejemplo). Las enzimas se inducen cuando las únicas fuentes de carbono disponibles para las bacterias son moléculas aromáticas. Los dos miembros mejor caracterizados de esta clase son catecol 1,2-dioxigenasa (CTD) y protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD).

\(\tag{5.55}\)

a. Caracterización de los Sitios Activos

Incluso antes de obtener la estructura cristalina de rayos X de PCD, se había construido una imagen del sitio activo mediante un trabajo espectroscópico detallado utilizando una variedad de métodos. El éxito de los análisis espectroscópicos de estas enzimas es un ejemplo particularmente bueno de la importancia y utilidad de dichos métodos en la caracterización de metaloproteínas. Las dos enzimas referidas en Reacción (5.55) tienen diferentes pesos moleculares y composiciones de subunidades, ⁶⁶ pero aparentemente contienen estructuras de sitio activo muy similares y funcionan por mecanismos muy similares. En ambos, el estado de reposo de la enzima contiene un ion Fe ^III unido al sitio activo. Los espectros de EPR muestran una resonancia a g = 4.3, característica del Fe ^III de alto espín en un ambiente llamado rómbico (baja simetría), ⁶⁶ y los parámetros de Mössbauer también son característicos del férrico de alto espín. ^66-68 Las reacciones con análogos de sustrato (ver abajo) provocan desplazamientos espectrales del cromóforo de hierro, sugiriendo fuertemente que el sustrato se une directamente al centro de hierro en el transcurso de la reacción enzimática.

Es sencillo descartar la presencia de hemo en estas enzimas, ya que el cromóforo hemo tiene bandas de absorción electrónica características en las regiones visible y ultravioleta con altos coeficientes de extinción, los cuales no se observan para estas proteínas. Asimismo, no se observan los rasgos espectrales característicos de otros cofactores conocidos o centros hierro-azufre. En cambio, la característica dominante en el espectro de absorción visible es una banda con un máximo cercano a 460 nm y un coeficiente de extinción molar de 3000 a 4000 M ^-1 cm ^-1 por hierro (ver Figura 5.5).

Figura 5.5 - Espectros de absorción visible de catecol 1,2-dioxigenasa y su complejo sustrato: E, enzima nativa; ES, complejo enzima-sustrato. ⁶⁶

Este tipo de espectro de absorción electrónica es característico de una clase de proteínas, algunas veces denominadas proteínas de tirosinato de hierro, que contienen ligandos tirosina unidos al hierro (III) en sus sitios activos, y que en consecuencia muestran el espectro de absorción visible característico debido al fenolato a hierro (III) transiciones de transferencia de carga. Esta asignación se puede probar definitivamente mediante el examen del espectro Raman de resonancia, que muestra la mejora de los modos vibracionales característicos de tirosina (típicamente ~1170, 1270, 1500 y 1600 cm ^-1) cuando la muestra es irradiada en la banda de transferencia de carga descrita anteriormente. Se puede observar que los complejos férricos de ligandos de fenolato dan espectros Raman de resonancia casi idénticos (ver Figura 5.6).

Figura 5.6 - Especta Raman de resonancia de (A) Fe ^LLi (salen) (O - C ₆ H ₄ -4 - CH ₃) y (B) catecol 1,2-dioxigenasa. ⁶⁶

Estas bandas han sido asignadas como una vibración de flexión C—H y una vibración de estiramiento C—O y dos C—C del ligando fenolato. ⁶⁹ Además, los estudios de RMN de las tasas de relajación de los espines protónicos del agua indican que el agua interactúa con el centro paramagnético Fe ^III en la enzima. Esta conclusión se apoya en el ensanchamiento de la señal de Fe ^III EPR en presencia de H ₂ ¹⁷ O, debido a la interacción con el espín I =\(\frac{5}{2}\) nuclear de ¹⁷ O. Así, numerosos estudios espectroscópicos de las catecol dioxigenasas condujeron a la predicción de que el El ion férrico de alto espín se enlazó a ligandos tirosina y agua. Además, los datos de EXAFS, así como la semejanza de las propiedades espectrales con otra proteína hierro-tirosinato mejor caracterizada, es decir, la transferrina (ver Capítulo 1), sugirieron que las histidinas también se encontrarían como ligandos del hierro en estas proteínas. ^66,67

Los resultados cristalográficos preliminares de rayos X sobre protocatecuato 3,4-dioxigenasa apoyan completamente las predicciones anteriores basadas en estudios espectroscópicos. ⁷⁰ El centro Fe ^ILi está unido a dos ligandos histidina y dos tirosina y un agua, los cinco ligandos están dispuestos en una disposición bipiramidal trigonal, con una tirosina y una histidina localizados en posiciones axiales, y con el ligando ecuatorial de agua o hidróxido orientado hacia un cavidad que se supone que es la cavidad de unión al sustrato. La cavidad también contiene el grupo guanidinio cargado positivamente de una cadena lateral de arginina, en la posición correcta para interactuar con el grupo carboxilato cargado negativamente en el sustrato protocatecuato (ver Figura 5.7).

Figura 5.7 - Una vista del sitio activo de la protocatecuato 3,4-dioxigenasa basada en los resultados de la estructura cristalina de rayos X. ⁷⁰ El centro Fe ^III es aproximadamente bipiramidal trigonal, con Tyr-147 e His-162 como ligandos axiales, y Tyr-108 e His-160 en el plano ecuatorial junto con una molécula solvente (no mostrada) en primer plano. ⁶⁶

b. Estudios Mecanicistas

Como se mencionó anteriormente, los sustratos e inhibidores que son análogos de sustrato se unen a estas enzimas y provocan distintos cambios en las propiedades espectrales, sugiriendo fuertemente que interactúan directamente con el centro Fe ^III. Sin embargo, los espectros siguen siendo característicos del estado de oxidación del Fe ^IIl, lo que indica que el centro férrico no se ha reducido. Los catecolatos son excelentes ligandos para Fe ^III (ver, por ejemplo, los sideróforos catecolados, Capítulo 1) y por lo tanto se podría suponer que el sustrato de catecol se uniría al hierro usando ambos átomos de oxígeno (ver 5.56).

\(\tag{5.56}\)

Sin embargo, la observación de que los inhibidores fenólicos p-X-C _{6H 4} -OH se unen fuertemente a las enzimas sugirió la posibilidad de que el sustrato se una al centro de hierro a través de un solo átomo de oxígeno (ver 5.57).

\(\tag{5.57}\)

Figura 5.8).

Figura 5.8 - (A) Espectros de RMN de ^1H-RMN desplazados paramagnéticamente de complejos de Fe (salen) con ligandos de 4-metilfenolato y 4-metilcatecolato. Las resonancias estrelladas se asignan a los grupos metilo. El espectro superior es del complejo férrico-salen del ligando monodentado de 4-metilfenolato. El espectro medio es del complejo férrico-salen del ligando 4-metilcatecolato monoprotonado. Obsérvese que dos isómeros están presentes, debido a que los dos átomos de oxígeno en el ligando son inequivalentes, y cualquiera de ellos puede ser utilizado para hacer el complejo monodentado. El espectro inferior es del complejo férrico-salen del ligando 4-metilcatecolato completamente desprotonado, que se une al hierro de manera bidentada. Obsérvese el menor lapso de desplazamientos isotrópicos, que se ha demostrado que es diagnóstico de coordinación bidentada. (B) Espectros de RMN ¹ H-NMR paramagnéticamente desplazados de complejos enzima-sustrato de las enzimas dioxigenasas catecol 1,2-dioxigenasa (CTD) y protocatecolato 3,4-dioxigenasa (PCD). Obsérvese el parecido entre la posición de la resonancia de metilo en el complejo de 4-metilcatecol con CTD y la de una de las resonancias de metilo en el espectro medio en (A), lo que indica que el 4-metilcatecol se une al centro férrico en CTD de manera monodentada a través del oxígeno O-1 solamente. Por el contrario, el espectro de 4-metilcatecol con PCD se asemeja al espectro inferior en (A), lo que indica que aquí el ligando 4-metilcatecolato es bidentado. ⁶⁶

Estos resultados contradicen una hipótesis temprana de que el modo de unión al sustrato, es decir, monodentado versus bidentado, podría ser un factor crucial en la activación del sustrato para la reacción con dioxígeno. ⁶⁷

Las observaciones espectroscópicas de las enzimas durante las reacciones con sustratos y análogos de sustrato han permitido a los investigadores observar varios intermedios a lo largo de la vía catalítica. Dichos estudios han llevado a la conclusión de que el centro de hierro sigue siendo Fe ^III de alto espín a lo largo de todo el curso de la reacción. Esta conclusión presenta inmediatamente un problema en la comprensión de la naturaleza de la interacción del dioxígeno con la enzima, ya que el dioxígeno no interactúa en general con iones metálicos altamente oxidados como el Fe ^III. La solución parece ser que esta reacción representa un ejemplo de activación de sustrato más que de dioxígeno.

Los estudios sobre la oxidación de los complejos de coordinación de catecolatos férricos han sido útiles para explorar las posibilidades mecanicistas de estas enzimas. ⁷¹ Se ha encontrado que una serie de complejos férricos de 3,5-di-t-butil-catecol con diferentes ligandos L reaccionan con _O2 para dar oxidación del ligando catecol (Reacción 5.58)

\(\tag{5.58}\)

Figura 5.9) y que los complejos de ligandos que son donantes pobres tienden a favorecer la donación de electrones del catecol a Fe III, aumentando así la cantidad relativa de la forma menor B. Cabe señalar que las características espectroscópicas de estos complejos están dominadas, sin embargo, por la forma de resonancia mayor A, independientemente de la naturaleza de L.

Todos estos estudios de las enzimas y sus complejos modelo han conducido al mecanismo resumido en la Figura 5.9. ⁶⁶ En este mecanismo propuesto, el sustrato de catecol se coordina con el centro férrico ya sea de manera monodentada o bidentada, desplazando presumiblemente al ligando de agua o hidróxido. El complejo catecol resultante reacciona luego con dioxígeno para dar un derivado peroxi del sustrato, el cual permanece coordinado con Fe ^Ill. El posterior reordenamiento de esta especie peroxi para dar un intermedio anhídrido es análogo a las reacciones bien caracterizadas que ocurren cuando los catecoles se hacen reaccionar con peróxido de hidrógeno alcalino. ⁷² La observación de que ambos átomos de oxígeno derivados del O ₂ se incorporan al producto requiere que el complejo de óxido férrico o hidróxido formado en la etapa que produce el anhídrido no se intercambie con agua externa antes de reaccionar con el anhídrido para abrirlo hasta el producto diácido.

Figura 5.9 - Mecanismo propuesto para catecol dioxigenasas (modificado a partir de la Referencia 45). La forma principal A se muestra aquí con el catecol unido de manera monodentada. A veces también puede estar encuadernado de manera bidentada (ver texto).

Es interesante considerar cómo las enzimas intradiol dioxigenasa superan las barreras cinéticas a las oxidaciones por dioxígeno, y por qué es poco probable que este mecanismo en particular sea aplicable a las enzimas monooxigenasas. El primer punto es que el catecol férrico intermedio es paramagnético, con formas de resonancia que ponen densidad de electrones desapareados sobre el carbono que reacciona con el dioxígeno. Por lo tanto, la restricción de giro no es un problema. Además, el ligando catecol es un muy buen agente reductor, mucho más que los sustratos típicos de las enzimas monooxigenasas (ver siguiente sección). Es posible, por lo tanto, que la reacción del dioxígeno con el complejo de catecol férrico dé como resultado una transferencia concertada de dos electrones para dar un intermedio peroxi, evitando así la reducción relativamente desfavorable de un electrón de O ₂.