6.1: Componentes Redox Biológicos

Tres tipos de centros de oxidación-reducción (redox) se encuentran en biología: cadenas laterales de proteínas, moléculas pequeñas y cofactores redox. La primera clase es frecuentemente pasada por alto por los enzimólogos mecanicistas. El grupo sulfhidrilo de la cisteína se oxida fácilmente para producir un dímero, conocido como cistina:

\[2R-SH \xrightarrow[-2H^{+}]{-2e^{-}} R-S-S-R \tag{6.1}\]

Se sabe que este tipo de interconversión ocurre en varias proteínas redox, incluyendo xantina oxidasa, ion mercúrico reductasa y tiorredoxina. Otros sistemas enzimáticos muestran evidencia espectral que apunta a la presencia de un radical basado en proteínas en al menos un intermedio. La espectroscopia EPR proporciona una poderosa herramienta en el estudio de tales sistemas; la observación de una señal g = 2.0 que no puede atribuirse a impurezas o un cofactor redox orgánico generalmente se toma como evidencia de un radical basado en proteínas. Los radicales localizados en la tirosina (por ejemplo, en el fotosistema II y la subunidad B2 de la ribonucleótido reductasa ¹) y el triptófano (por ejemplo, en el citocromo c peroxidasa ² de levadura) se han identificado sin ambigüedades usando técnicas de EPR junto con muestras de proteínas que contienen amino marcado isotópicamente ácidos (por ejemplo, Tyr perdeuterado) o mutaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, Trp → Phe).

Una variedad de moléculas pequeñas, tanto orgánicas como inorgánicas, pueden funcionar como reactivos redox en sistemas biológicos. De estas, solo las coenzimas nicotinamida y quinona se encuentran en toda la biosfera. Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) participan en una amplia variedad de reacciones redox biológicas. La posición 4 del anillo de piridina es la porción reactiva de ambas moléculas (Figura 6.1). Ambos suelen funcionar como reactivos redox de 2 electrones.

Figura 6.1 - Reducción de NAD ⁺ a NADH.

Por el contrario, las quinonas pueden funcionar como portadores de 1 o 2 electrones:

\[Q \xrightleftharpoons{e^{-},H^{+}} QH \cdotp \xrightleftharpoons{e^{-},H^{+}} QH_{2} \tag{6.2}\]

Los intermedios de semiquinona de radicales libres (QH•) se han detectado mediante espectroscopía EPR en algunas transferencias de electrones. La coenzima Q, también llamada ubiquinona porque se presenta en prácticamente todas las células, contiene una larga cola isoprenoide que le permite difundirse a través de las membranas rápidamente. Este derivado de quinona, que ocurre tanto en formas libres como unidas a proteínas, se denomina ubiquinol cuando se reduce (Figura 6.2). Otros tipos de quinonas se encuentran con menor frecuencia en las células.

Figura 6.2 - Reducción de la coenzima Q (ubiquinona) a ubiquinol.

Las metaloproteínas que contienen un solo tipo de cofactor redox se pueden dividir en dos clases generales: portadores de electrones y proteínas involucradas en el transporte o activación de moléculas pequeñas. Adman ³ ha identificado algunos de los factores que parecen ser característicos de las proteínas de transferencia de electrones (estas proteínas a veces se llaman “transferasas de electrones”): (a) posesión de un cofactor adecuado para actuar como sumidero de electrones; (b) colocación del cofactor lo suficientemente cerca de la superficie de la proteína para permitir que los electrones se muevan dentro y fuera; (c) existencia de una capa hidrofóbica adyacente al cofactor, pero que no siempre lo rodea completamente; (d) pequeños cambios estructurales que acompañan a la transferencia de electrones; y (e) una arquitectura que permite una ligera expansión o contracción en direcciones preferidas tras la transferencia de electrones.

Las proteínas que funcionan como transferasas de electrones suelen colocar sus grupos protésicos en un ambiente hidrófobo y pueden proporcionar enlaces de hidrógeno (además de ligandos) para ayudar a estabilizar las formas oxidadas y reducidas del cofactor. Los enlaces metal-ligando permanecen intactos tras la transferencia de electrones para minimizar la reorganización de la esfera interna ⁴ (discutida en la Sección III). Muchas de las metaloenzimas multisitio complejas (por ejemplo, citocromo c oxidasa, xantina oxidasa, la proteína nitrogenasa FeMO) contienen centros redox que funcionan como transferasas de electrones intramoleculares, transportando electrones hacia/desde otros centros metálicos que se unen a ligandos exógenos durante el recambio enzimático.

Existen cuatro clases ^3,5 de electrón transferasas, cada una de las cuales contiene muchos miembros que presentan importantes diferencias estructurales: flavodoxinas, proteínas de cobre azul, proteínas de hierro-azufre y citocromos.

Las flavodoxinas ⁶ son atípicas ya que contienen un cofactor redox orgánico, el mononucleótido de flavina (FMN; ver Figura 6.3). Estas proteínas tienen pesos moleculares en el rango de 8-13 kDa, y se encuentran en muchas especies de bacterias y algas. El cofactor FMN se encuentra en un extremo de la proteína, cerca de la superficie molecular, pero solo la porción de dimetilbenceno de FMN se expone significativamente al disolvente (Figura 6.4). FMN puede actuar como un centro redox de 1 o 2 electrones. En solución, la forma semiquinona de FMN libre es inestable y se desproporciona a las formas quinona (oxidada) e hidroquinona (reducida). De ahí que la FMN libre funcione en efecto como un reactivo de 2 electrones. FMN en flavodoxinas, por otro lado, puede funcionar como un portador de un solo electrón. Esto se puede discernir fácilmente comparando los potenciales de reducción para FMN libre y unido a proteínas (Cuadro 6.1). Claramente, el medio proteico es responsable de esta drástica alteración en la estabilidad del estado de oxidación. A partir de un estudio de RMN ⁷ de las tasas de autointercambio electrónico flavodoxina quinona/semiquinona y semiquinona/hidroquinona de M. elsdenii, se concluyó que esta última es aproximadamente 300 veces más rápida que la primera, de acuerdo con la opinión de que la pareja redox fisiológicamente relevante es semiquinona/hidroquinona.

Figura 6.3 - Reducción de FMN.

Figura amablemente proporcionada por M. L. Ludwig.

Cuadro 6.1 - Potenciales de reducción de parejas FMN.

Abreviaturas: Q, quinona; SQ, semiquinona; HQ, hidroquinona.

	E°Q/SQ	E°SQ/HQ
FMN Libre	-238 mV	-172 mV
C.M.P. flavodoxina	-92 mV	-399 mV

Las proteínas de cobre azul se caracterizan por una intensa absorción de transferencia de carga S (Cys) → Cu cerca de 600 nm, un espectro EPR axial que muestra una constante de acoplamiento hiperfina inusualmente pequeña y un potencial de reducción relativamente alto. ^4,8-10 Con pocas excepciones (por ejemplo, organismos fotosintéticos), sus papeles precisos en la fisiología bacteriana y vegetal siguen siendo oscuros. Las estructuras de rayos X de varias proteínas de cobre azul indican que la geometría del sitio de cobre es aproximadamente plano trigonal, como lo ilustra la estructura de azurina de Alcaligenes denitrificans (Figura 6.5). ^11,12 En todas estas proteínas, tres ligandos (uno Cys, dos His) se unen fuertemente al cobre en un arreglo trigonal. Las diferencias en las interacciones entre el centro de cobre y los ligandos dispuestos axialmente pueden contribuir significativamente a variaciones en el potencial de reducción que se observan ¹² para las transferasas de electrones de cobre azul. Por ejemplo, E°' = 276 mV para la azurina de A. denitrificans, mientras que la de la plastocianina de P. vulgaris es de 360 mV. En la azurina de A. denitrificans, el enlace Cu-S (Met) es 0.2 Å más largo que en la plastocianina de álamo, y hay un oxígeno carbonilo 3.1 Å del centro de cobre, en comparación con 3.8 Å en plastocianina. Se espera que estas diferencias en la longitud de los enlaces estabilicen el Cu ^II en la azurina en mayor medida que en la plastocianina, y resulten en un menor valor de E°' para la azurina.

Figura 6.5 - Estructura del centro de cobre azul en azurina. ¹¹

Las proteínas hierro-azufre desempeñan papeles importantes ^13,14 como portadores de electrones en prácticamente todos los organismos vivos, y participan en la fotosíntesis vegetal, la fijación de nitrógeno, el metabolismo de esteroides y la fosforilación oxidativa, así como en muchos otros procesos (Capítulo 7). Los espectros ópticos de todas las proteínas hierro-azufre son muy amplios y casi sin rasgos, debido a las numerosas transiciones de transferencia de carga superpuestas que imparten colores rojo-marrón-negro a estas proteínas. Por otro lado, los espectros EPR de los conglomerados hierro-azufre son bastante distintivos, y son de gran valor en el estudio de la química redox de estas proteínas.

Las proteínas hierro-azufre más simples, conocidas como rubredoxinas, se encuentran principalmente en bacterias anaerobias, donde se desconoce su función. Las rubredoxinas son proteínas pequeñas (6 kDa) y contienen hierro ligado a cuatro sulfuros Cys en un arreglo tetraédrico distorsionado. El valor de E°' para el par Fe ^III/^II en agua es de 770 mV; el de C. pasteurianum rubredoxina es de -57 mV. Los potenciales de reducción de las proteínas hierro-azufre son típicamente bastante negativos, lo que indica una estabilización de la forma oxidada del par redox como resultado de ligandos de azufre cargados negativamente.

Las [2Fe-2S] ferredoxinas (10-20 kDa) se encuentran en cloroplastos vegetales y tejido de mamíferos. La estructura de la ferredoxina ¹⁵ de Spirulina platensis confirmó sugerencias anteriores, basadas en estudios de EPR y Mössbauer, de que los átomos de hierro están presentes en una estructura de racimo de espín acoplado [2Fe-2S]. La reducción de un electrón (E°' ~ -420 mV) de la proteína da como resultado un dímero de valencia mixta (Ecuación 6.3):

\[[Fe_{2}S_{2}(SR)_{4}]^{2-} \xrightleftharpoons[-e^{-}]{+e^{-}} [Fe_{2}S_{2}(SR)_{4}]^{3-} \tag{6.3}\]

\[Fd_{ox} \qquad \qquad \qquad Fd_{red}\]

\[2Fe(III) \qquad \qquad Fe(II) + Fe(III)\]

El electrón adicional en _rojo Fd se asocia con solo uno de los sitios de hierro, lo que resulta en una estructura llamada de valencia atrapada. ¹⁶ El estado de oxidación en racimo [Fe _{2 S 2} (SR) ₄^{] 4-}, que contiene dos iones ferrosos, se puede producir in vitro cuando se utilizan reductores fuertes.

Se encuentran cúmulos de cuatro hierro [4Fe-4S] en muchas cepas de bacterias. En la mayoría de estas proteínas bacterianas de hierro-azufre, también llamadas ferredoxinas, dos de estos grupos están presentes en la proteína. Estas proteínas tienen potenciales de reducción en el rango de -400 mV y son bastante pequeñas (6-10 kDa). Cada uno de los racimos contiene cuatro centros de hierro y cuatro sulfuros en las partes alternas de un cubo distorsionado. Cada hierro se coordina a tres sulfuros y un tiolato de cisteína. Los hierros están fuertemente acoplados por intercambio, y el racimo [4Fe-4S] en ferredoxinas bacterianas es paramagnético cuando se reduce en un electrón. Las llamadas “proteínas de hierro-azufre de alto potencial” (HIPIP) se encuentran en bacterias fotosintéticas y presentan potenciales de reducción anómalos (~350 mV). La estructura de HiPIP de C. vinosum (10 kDa) demuestra que los HIPIP son distintos de las [4Fe-4S] ferredoxinas, y que la estructura reducida del grupo de HiPIP está significativamente distorsionada, como también se observa para la estructura de la ferredoxina oxidada de P. aerogenes. Además, el HiPIP oxidado es paramagnético, mientras que la proteína reducida es EPR-silenciosa.

Este conjunto desconcertante de observaciones experimentales se puede racionalizar en términos de una hipótesis de “tres estados” (es decir, [4Fe-4S (SR) ₄] ^n- los clústeres existen en tres estados de oxidación fisiológica). ¹⁷ Esta hipótesis explica muy bien las diferencias en el comportamiento magnético y las propiedades redox observadas para estas proteínas hierro-azufre (Ecuación 6.4):

\[[4Fe-4S(SR)_{4}]^{-} \xrightleftharpoons[-e^{-}]{+e^{-}} [4Fe-4S(SR)_{4}]^{2-} \xrightleftharpoons[-e^{-}]{+e^{-}} [4Fe-4S(SR)_{4}]^{3-} \tag{6.4}\]

\[HiPIP_{ox} \qquad \qquad \qquad HiPIP_{red} \qquad \qquad \qquad Ferredoxin_{red}\]

\[Ferredoxing_{ox}\]

Las ferredoxinas bacterianas y los HIPIP poseen agregados de tetracubane que contienen ligandos de tiolato, pero los primeros utilizan el par redox de racimo -2/-3, mientras que los segundos utilizan el par redox de racimo -1/-2.

El ambiente proteico ejerce así una poderosa influencia sobre los potenciales de reducción de conglomerados. Esta observación se aplica a todas las clases de transferencias de electrones: los factores que son determinantes críticos de los potenciales de reducción de cofactores son poco conocidos en la actualidad, pero se piensa que ¹⁸ incluyen las constantes dieléctricas bajas de los interiores de proteínas (~4 para proteínas vs. ~78 para H ₂ O), efectos electrostáticos debidos a residuos de aminoácidos cargados cercanos, enlaces de hidrógeno y restricciones geométricas impuestas por la proteína.

Como clase, los citocromos ^19-22 son los más caracterizados de las electrón transferasas. Por definición, un citocromo contiene uno o más cofactores hemo. Estas proteínas fueron de las primeras en ser identificadas en extractos celulares por sus propiedades ópticas distintivas, particularmente una absorción intensa en la región de 410-430 nm (llamada banda Soret). Los citocromos se clasifican típicamente en base al tipo hemo. La Figura 6.6 muestra los tres tipos de hemo más comúnmente encontrados: el hemo a posee una larga “cola” de fittilo y se encuentra en la citocromo c oxidasa; el hemo b se encuentra en citocromos y globinas de tipo b; el hemo c se une covalentemente a citocromos de tipo c a través de dos enlaces tioéter. ¡La nomenclatura del citocromo presenta un verdadero reto! Algunos citocromos se designan de acuerdo con el orden histórico de descubrimiento, por ejemplo, el citocromo c ₂ en la fotosíntesis bacteriana. Otros se designan de acuerdo con el\(\lambda_{max}\) de la\(\alpha\) banda en el espectro de absorción de la proteína reducida (e.g., citocromo c ₅₅₁).

Figura 6.6 - Estructuras de hemos a, b y c.

Los citocromos c están muy extendidos en la naturaleza. Ambler ²³ dividió estos portadores de electrones en tres clases por motivos estructurales. Los citocromos de Clase I c contienen ligandos axiales His y Met, con el hemo localizado cerca del N-terrninus de la proteína. Estas proteínas son globulares, como lo indica el dibujo de cinta del citocromo c de atún (Figura 6.7). Las estructuras de rayos X de citocromos Clase I c de una variedad de eucariotas y procariotas muestran claramente un “pliegue de citocromo” evolutivamente conservado, con el borde del hemo expuesto al disolvente. Los potenciales de reducción de estos citocromos son bastante positivos (200 a 320 mV). El citocromo c de mamíferos, debido a su papel distintivo en la cadena mitocondrial de transferencia de electrones, se discutirá más adelante.

Figura 6.- Estructura del citocromo de atún c.

Los citocromos de clase II c (E°' ~ -100 mV) se encuentran en bacterias fotosintéticas, donde cumplen una función desconocida. A diferencia de sus primos Clase I, estos citocromos de tipo c son de alto espín: el hierro es de cinco coordenadas, con un ligando His axial. Estas proteínas, generalmente denominadas citocromos c', son haces\(\alpha\) de cuatro hélices (Figura 6.8). El sitio de coordinación axial vacante está enterrado en el interior de la proteína.

Figura 6.8 - Estructura del citocromo c'.

Finalmente, los citocromos de Clase III c, también llamados citocromos c ₃, contienen cuatro hemos, cada uno ligado por dos histidinas axiales. Estas proteínas se encuentran en una clase restringida de bacterias reductoras de sulfato y pueden estar asociadas con la membrana citoplásmica. Los bajos pesos moleculares de los citocromos _c3 (~14. 7 kDa) requieren que los cuatro hemos estén mucho más expuestos al disolvente que los hemos de otros citocromos (ver Figura 6.9), los cuales pueden ser en parte responsables de sus potenciales de reducción inusualmente negativos (-200 a -350 mV). Estas proteínas poseen muchos residuos aromáticos y distancias hemo-hemo cortas, dos propiedades que podrían ser responsables de su conductividad eléctrica de estado sólido anómalo grande. ²⁴

Figura 6.9 - Estructura del citocromo c ₃.