3.5: Cre-Lox, Líneas Conductoras y Especificidad de Siguiente Orden

¿Qué es el sistema Cre-lox y por qué lo necesitamos?

En los capítulos anteriores hemos examinado el uso de técnicas moleculares recombinantes que ayudan a los neurobiólogos a comprender el papel de neuronas específicas dentro de un circuito cerebral en un comportamiento complejo. Sin embargo, aún no hemos examinado cómo asegurar el suministro a neuronas específicas para asegurar que la construcción (es decir, ChR2, hM3DR u otras construcciones) no se expresa de manera inapropiada en otros tipos de células ni en otras neuronas. En lugar de depender únicamente de que la maquinaria interna de las células sea impulsada por promotores de genes específicos de células, el sistema Cre-lox se usa a menudo en neurociencia. Este es un método poderoso para manipular selectivamente la expresión génica en subconjuntos específicos de tejidos. Existen 2 elementos para que este sistema funcione eficazmente; secuencias loxP que se crean de novo y la presencia de Cre-recombinasa (una nucleasa exógena). Es importante destacar que ni la enzima nucleasa Cre recombinasa ni las secuencias loxP normalmente se encuentran en sistemas de mamíferos, por lo que su introducción no tiene consecuencias funcionales para el ADN ni para las neuronas. Los sitios loxP modificados genéticamente son secuencias de ADN de 34 pb que se unen a la proteína Cre-recombinasa (y la nucleasa siempre necesita unirse a 2 sitios loxP). Curiosamente, como se muestra en la Figura\(\PageIndex{1}\), cuando los sitios loxP están en la misma orientación (5' a 3') y Cre-recombinasa se une a ambos, esto provoca la deleción de la secuencia de ADN entre los sitios loxP mientras deja un loxP. Este tipo de reacción de “floxing” se conoce como escisión. Si los sitios loxP están en la orientación opuesta entonces la secuencia entre ellos es invertida o “volteada”.

Figura\(\PageIndex{1}\). Las diferentes orientaciones de los sitios loxP alrededor de la secuencia de ADN de interés provocarán la escisión (eliminación del ADN) o la inversión de la secuencia de ADN.

Líneas CRE-driver: Un tipo especial de ratón transgénico

Como la Cre-recombinasa no tiene efecto sobre el ADN excepto aquellos que contienen sitios loxP (que nunca se encuentran en el ADN de mamíferos), la generación de modelos de ratón Cre-recombinasa transgénicos fue un paso lógico en el examen de la expresión específica de herramientas genéticas (optogenéticas, quimiogenéticas u otras) en neuronas. Como diferentes neuronas tienen diferente maquinaria celular para activar y expresar ciertos genes, Cre-recombinasa fue dirigida a neuronales específicos (u otros tipos de células cerebrales) con esto en mente. A medida que la expresión de Cre-recombinasa estaba siendo “impulsada” por la maquinaria específica de un tipo celular, el término líneas conductoras de CRE-se ha incorporado dentro de la neurobiología. Como se muestra en la Figura\(\PageIndex{2}\) siguiente, diferentes tipos de neuronas, ya sean inhibidoras, excitadoras u otras, tienen proteínas específicas y por lo tanto genes que permitirían la expresión específica de la Cre-recombinasa exógena. Por ejemplo, el ratón TH: :IRES-CRE-recombinasa solo expresa Cre-recombinasa dentro de las neuronas dopaminérgicas ya que TH (tirosina hidroxilasa) es la enzima sintética que convierte el aminoácido tirosina en dopamina en las neuronas. En el mismo sentido, VGAT: :IRES-CRE-recombinasa sería una línea de ratón transgénico que se utilizaría para investigar neuronas GABAérgicas inhibitorias. Una lista de diferentes genes/productos proteicos se encuentra tanto en la Figura\(\PageIndex{2}\) como en la siguiente tabla.

Figura\(\PageIndex{2}\). Expresión diferencial de proteínas en grupos específicos de neuronas, incluyendo los tipos dopaminérgicos, glutamatérgicos excitatorios y GABAérgicos inhibitorios que permiten la expresión dirigida de Cre-recombinasa en subconjuntos específicos de neuronas.

Mesa\(\PageIndex{1}\). Ejemplos de células dirigidas con Cre-Recombinasa

Línea de conductor	Tipos celulares específicos — Cre-Recombinasa
GFAP-CRE	Astrocitos o células madre neuronales
Nestin-Cre	Células madre neuronales o células precursoras
CAG-Cre	Promotor general: Expresión ubicua en todas las células del cerebro
Synapsin I-Cre	Todas las neuronas (todos los tipos de neuronas
EF1a-CRE	Promotor general: Expresión ubicua en todas las células del cerebro