2.15: Bilirrubina (Aguas y Gerede — Método DMSO)

LECTURA RELACIONADA: Capítulos 27, 36 Ver Métodos en CD-ROM para Bilirrubina.

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión apropiada y lectura relacionada, el alumno podrá:

1. Realizar análisis de bilirrubina directa y total en 2 muestras con 90% de precisión.
2. Explicar el efecto de la hemoglobina libre en las determinaciones de bilirrubina en este método.

PRINCIPIO

La bilirrubina reaccionará con ácido sulfanílico diazotado para producir un compuesto púrpura, la azobilirrubina. Este producto se puede cuantificar espectrofotométricamente a 560 nm. Este procedimiento se utiliza para medir la bilirrubina conjugada soluble (de reacción directa) sola o en combinación con la bilirrubina no conjugada (de reacción indirecta) menos soluble. Para medir la bilirrubina total, se utiliza un solvente adecuado que permite la medición de bilirrubina de reacción directa e indirecta. La concentración de bilirrubina no conjugada es la diferencia entre los valores de bilirrubina de reacción directa y total. Se debe tener cuidado para proteger las muestras de la luz fuerte o prolongada porque los pigmentos de bilirrubina son sensibles a la luz.

MATERIALES

• Reactivo de bilirrubina total
• Espectrofotómetro
• Bilirrubina de reacción directa
• Cubetas
• Nitrito de sodio
• Pipetas
• Estándar
• 13 x 100 mm
• Tubos de ensayo
• Controles
• Muestras

PROCEDIMIENTO

Bilirrubina Total

1. Marque un número suficiente de tubos de ensayo de 13 x 100 mm como “Prueba” y “Blanco” para cada estándar, control y muestra de suero a analizar.
2. Agregar 3 mL de reactivo de bilirrubina total a todos los tubos “Blank” y “Test”.
3. Usando una pipeta Pasteur, agregue 1 gota de reactivo de nitrito de sodio a cada tubo de “Test”.
4. A intervalos precisos de un minuto, agregue 200\(\mu\) L del estándar/control/muestra apropiado a cada tubo “Test” y “Blank”.
5. Mezclar bien.
6. Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 5 minutos.
7. Lea la absorbancia de la primera muestra frente a su propio blanco a 560 nm; repita para cada muestra posterior a intervalos de 1 minuto.
8. Registre sus resultados en la hoja de datos.

Bilirrubina Directa

1. Etiquete un número suficiente de tubos de ensayo de 13 x 100 mm como “Blank” y “Test” solo para las muestras del paciente.
2. Añadir 3 mL de reactivo de bilirrubina directa a cada tubo “Blank” y “Test”.
3. Usando una pipeta Pasteur, agregue 1 gota de reactivo de nitrito de sodio a cada tubo de “Test”.
4. A intervalos precisos de un minuto, agregue 200\(\mu\) L de suero al tubo “Blank” y “Test” para cada muestra y mezcle.
5. Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 5 minutos.
6. Lea la absorbancia de la primera muestra frente a su propio blanco a 560 nm; repita para cada muestra posterior a intervalos de 1 minuto.
7. Registre sus resultados en la hoja de datos.

EJERCICIO OPCIONAL

1. Preparar glóbulos rojos lavados libres de plasma. Resuspender las células con agua destilada a 5 veces el volumen de sangre original.
2. Agregar 0.05 mL de este hemolizado a uno de los controles o muestras ejecutadas en el procedimiento anterior descrito para la bilirrubina total.
3. Registrar los resultados en la hoja de datos.

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #15

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

	Absorbancia (total)	Bilirrubina Total (mg/L)	Absorbancia Directa	Bilirrubina directa (conjugada) (mg/L)	Indirecto (bilirrubina no conjugada (mg/L)
Estándar
Control Normal
Control Anormal
N.° de muestra
N.° de muestra

CÁLCULOS

Calcular la bilirrubina total para los controles y muestras de suero. Calcular la bilirrubina directa e indirecta para las muestras de suero del paciente. Utilice el método de proporción de absorbancia/concentración.

\[\text{Total bilirubin} = \text{conjugated (“direct”) bilirubin} - \text{unconjugated (“indirect”) bilirubin}\]

\[\text{Unconjugated bilirubin} = \text{Total} - \text{Direct bilirubin}\]

Ejercicio opcional

	Absorbancia	Bilirrubina Total (mg/L)
Muestra enriquecida con hemoglobinas
Muestra sin pinchos (#)

Preguntas de Discusión

1. ¿Qué sustancias se sabe que causan interferencia con este método?
2. ¿Por qué es necesario ejecutar un blanco de suero con cada muestra?
3. ¿Cuál es el propósito del nitrito de sodio en la reacción?
4. ¿El tipo de blanco empleado en este ejercicio es un reactivo o muestra en blanco?
5. ¿Qué compuesto se empleó en el reactivo “total” para solubilizar la bilirrubina no conjugada? ¿Qué otros solubilizantes también se utilizaron?