2.16: Colesterol (Total y HDL)

LECTURA RELACIONADA: Capítulo 33 Ver Métodos en CD-ROM para Colesterol.

OBJETIVO

Al finalizar este ejercicio, discusión y lecturas apropiadas,
el alumno podrá:

1. Determinar los valores de colesterol sérico con 90% de precisión.
2. Separar el HDL de otras partículas de lipoproteínas.
3. Determine los valores de colesterol HDL con 90% de precisión.
4. Utilizando los valores de triglicéridos, colesterol HDL y colesterol total, se calculan las concentraciones de colesterol LDL.

PRINCIPIO

El colesterol se puede medir por una variedad de métodos. El más común de los actualmente en uso utiliza una serie de vías enzimáticas para producir un producto medible. Las siguientes series de reacciones son ampliamente utilizadas para el punto de atención, métodos automatizados y manuales.

1. $$\ text {Colesterol - ésteres}\ xrightarrow {\ text {Colesterol esterasa}}\ text {Colesterol} +\ texto {Ácidos grasos} $$
2. $$\ text {Colesterol} + O_ {2}\ xrightarrow {\ text {Colesterol oxidasa}}\ text {Colesterol -4 - es -3-ona} + H_ {2} O_ {2} $$
3. $$H_ {2} O_ {2} + 4 -\ text {aminofenazona (o algún otro tinte)}\ xrightarrow {\ text {Peroxidasa}}\ text {Tinte oxidado}\; (A_ {max}, 500nm) + H_ {2} O$$

Este método se puede utilizar para determinar los valores de colesterol total y colesterol HDL.

MATERIALES

• Tubos de ensayo de 10 x 75 mm
• Muestras de Suero
• Reactivo de colesterol
• Pipetas
• Espectrofotómetro
• Controles
• Centrífuga Refrigerada
• Reactivo precipitante

Si está disponible, un analizador de punto de atención puede reemplazar los reactivos de colesterol y el
espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE COLESTEROL

(Esto puede ser reemplazado por un instrumento de punto de cuidado).

1. Etiquete tubos de ensayo de 13 x 100 mm para un estándar de colesterol total, control de nivel 2 y colesterol total para cada muestra de suero.
2. Pipetear 2.5 mL de reactivo de colesterol en cada tubo.
3. Agregar 30\(\mu\) L de muestra a tubos apropiados para el estándar de colesterol total, control de Nivel 2 y cada tubo de colesterol total de muestra de suero.
4. Mezclar bien e incubar a 37°C por 15 minutos.
5. Ajustar un espectrofotómetro a 500 nm y aplicarlo en blanco con agua destilada.
6. Después de la incubación, lea la absorbancia de cada patrón, control y muestra de suero usando cubetas apropiadas. Registre sus resultados en la hoja de datos.
7. Calcular los valores de colesterol total para el testigo y cada muestra de suero usando el método de proporción de absorbancia.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE COLESTEROL HDL

PRINCIPIO

En presencia de Mn ^{2 +} y heparina, se precipitan quilomicrones, VLDL y LDL, dejando solo HDL en solución. Los materiales precipitados se sedimentan por centrifugación y se puede eliminar el sobrenadante que contiene HDL.

PROCEDIMIENTO

1. Pipetear 1 mL de cada testigo y muestra en tubos de ensayo etiquetados de 10 x 75 mm.
2. Añadir 0.1 mL de reactivo precipitante (MnCl ₂ 1.06 M con heparina sódica añadida) a cada tubo y mezclar bien usando un mezclador tipo vortex.
3. Centrifugar a 2000 g por 30 minutos a 4°C.
4. Retire con cuidado el sobrenadante transparente en tubos de ensayo etiquetados de 10 x 75 mm con pipetas Pasteur y guárdalo para su posterior análisis.

PROCEDIMIENTO DE COLESTEROL HDL

1. Siga los pasos 1 y 2 del procedimiento de colesterol total.
2. Agregar 50\(\mu\) L de sobrenadante (del procedimiento de precipitación) al control de HDL y tubos de muestra de suero HDL, agregar 50\(\mu\) L de HDL estándar al tubo apropiado.
3. Siga los pasos del 4 al 7 del procedimiento de colesterol total.
4. Multiplique el valor final (del Paso 7) por 1.1 para corregir la dilución realizada en la etapa de precipitación.

FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #16

NOMBRE: ___________ FECHA: ___________

RESULTADOS

	ABSORBANCIA (500 nm)	Nivel de colesterol mg/L	HDL-C CORREGIDO mg/L
Colesterol Std
HDL Colesterol Std			(valor objetivo)
Control Nivel II
Control HDL			(valor objetivo)
N.° de muestra (Colesterol)
N.° de muestra (Colesterol HDL-C)
N.° de muestra (HDL-C)

CÁLCULOS

Calcular los valores de LDL y VLDL para cada muestra de suero y los controles usando las siguientes ecuaciones.

\[\text{VLDL cholesterol, mg/L} = \frac{\text{Triglyceride level (mg/L)}}{5}\]

\[\text{LDL cholesterol} = \text{total cholesterol} - \text{(VLDL cholesterol + HDL-C)}\]

Su instructor le proporcionará el nivel de triglicéridos medido para su muestra.

PREGUNTAS DE DISCUSIÓN

1. ¿Qué cálculos adicionales de lípidos se pueden hacer que sean clínicamente útiles?
2. Si hay quilomicrones, ¿qué pasos son necesarios para determinar el colesterol HDL?
3. ¿Qué sustancia (s) interferirán con las determinaciones de colesterol usando este método?
4. Si el nivel de triglicéridos de tu muestra fue >4000 mg/L, ¿podrías calcular el colesterol LDL?
5. Para cada una de las muestras de suero analizadas, discuta brevemente la imagen lipídica ilustrada por tus resultados. Ver Capítulo 33 en Kaplan y Pesce
6. ¿Por qué se emplearon dos estándares de colesterol en este ejercicio?