2.19: Análisis Cinético de Enzimas
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LECTURA RELACIONADA: Capítulos 54 y 55 Ver Métodos Aspartato aminotransferasa, o amilasa, o gamma-glutamil transferasa.
OBJETIVO
Al finalizar este ejercicio, lecturas apropiadas y
discusiones, el alumno podrá:
- Realizar un procedimiento enzimático cinético.
- Construir una gráfica para ilustrar la relación entre el tiempo y el cambio de absorbancia durante una reacción enzimática.
- Calcular la cantidad de actividad enzimática presente en la muestra.
PRINCIPIO
Para la mayoría de los ensayos enzimáticos, si la actividad se representa frente al tiempo, normalmente se generaría una curva con 3 fases generales. Una curva típica aparecería como se muestra a continuación.
La fase de rezago es el periodo durante el cual se establece la temperatura y el equilibrio cinético. La porción lineal es la fase de cinética de orden cero y es la fase durante la cual generalmente se realiza el análisis. La fase de agotamiento del sustrato ocurre cuando uno o más de los sustratos se agotan.
MATERIALES
- Reactivo enzimático
- Papel Grafico
- Incubadoras de muestras de suero
- Espectrofotómetro (UV)
- Incubadora a 37°C
PROCEDIMIENTO
- Pipetear 2.0 mL de reactivo enzimático en una cubeta limpia de 12 mm x 75 mm.
- Agregar 100\(\mu\) L de muestra al reactivo enzimático.
- Mezclar bien.
- Incubar a 37°C por 1 minuto.
- Ajustar la longitud de onda de un espectrofotómetro a 340 nm (o cualquier otra longitud de onda necesaria para monitorear la reacción).
- Blanquear el Instrumento (establecer 100% T, absorbancia cero) con agua destilada.
- Medir y registrar la absorbancia de la solución después del 1 minuto inicial y cada minuto después para un tiempo total de 15 minutos. Regresar la cubeta a la incubadora entre lecturas.
- Trazar las lecturas de absorbancia en el eje vertical versus el tiempo en el eje horizontal usando papel cuadriculado lineal. Conecta tus puntos para formar una curva suave.
- Trazar los valores\(Delta\) A en el eje vertical de la segunda gráfica versus el tiempo en el eje horizontal. Conecte los puntos para formar una curva suave.
Preguntas de Discusión
- Proponer una explicación para la forma de la gráfica de absorbancia vs tiempo. Marque las áreas de retraso, lineal y agotamiento del sustrato en su gráfica.
- ¿Cuáles son las relaciones entre las dos gráficas (A versus tiempo y\(\Delta\) A versus tiempo)?
- ¿Por qué las concentraciones de enzimas calculadas difieren en los diferentes momentos?
- ¿Cuál sería el efecto sobre la actividad enzimática calculada si el volumen de muestra en el experimento se redujera a la mitad?
| FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #19 |
NOMBRE: ___________ FECHA: ___________ |
RESULTADOS
| Tiempo (min) |
Absorbancia | \(\Delta\)A | Actividad enzimática calculada |
|---|---|---|---|
| 1 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 2 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 3 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 4 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 5 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 6 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 7 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 8 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 9 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 10 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 11 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 12 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 13 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 14 | \ (\ Delta\) A"> | ||
| 15 | \ (\ Delta\) A"> |
Calcular la cantidad de actividad enzimática en los puntos de tiempo indicados anteriormente usando la siguiente fórmula:
\[\text{U/L specimen} = \frac{\Delta A/min \times \text{total assay volume (mL)} \times 1000\; mL/L}{\text{abs. coeff.} \times \text{lightpath (cm)} \times \text{sample vol.(mL)}}\]
\(\Delta\)A = cambio en la absorbancia
1000 ml/L = factor para convertir unidades/ml a U/L
abs.coeff. = Coeficiente de absorbancia = 6.22 cm -1 x L x mmol -1 para NADH a 340nm
