2.30: Radioinmunoensayo (RIA)
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LECTURAS RELACIONADAS: Páginas 187-200, 249-250, 254-256.
OBJETIVO
Al finalizar este ejercicio, la discusión apropiada y las lecturas relacionadas, el alumno podrá:
- Explicar los principios básicos de los RIAs.
- Utilice los datos presentados para construir una curva estándar.
PRINCIPIO
Muchos inmunoensayos se basan en la competencia entre antígeno marcado y no marcado (Ag) por un número limitado de sitios de unión en moléculas de anticuerpos (Ab). Los radioinmunoensayos (RIAs) utilizan un isótopo inestable para etiquetar el antígeno. Los isótopos de uso común son tritio (3 H) y 125 I.
Todos los RIA son irnrnunoensayos heterogéneos, es decir, requieren la separación del antígeno unido a AB del antígeno libre marcado. Las técnicas comúnmente utilizadas para separar el marcador unido de libre incluyen: naffijar el anticuerpo a una fase sólida (tubos de ensayo, partículas de Sephadex o perlas de vidrio), precipitación de complejos de Ab-Ag por un segundo Ab o polietilenglicol, y absorción de Ag libre por carbón vegetal. Se puede contar el marcador libre o unido (generalmente este último), y la cantidad de radiactividad (recuentos o desintegraciones/minuto) está relacionada con la concentración de antígeno. Esta relación es compleja, y se han utilizado varias ecuaciones matemáticas para “linealizar” los datos. Una técnica común es graficar el %B/B0 en una escala lineal o logarítmica frente a la concentración de analito en una escala logarítmica. Otra técnica común es utilizar la gráfica logit de los estándares (generalmente _5) que tiene la siguiente relación:
\[\text{logit} \frac{B}{B_{0}} = \ln \frac{\frac{B}{B_{0}}}{1 - \frac{B}{B_{0}}}\]
donde: B = recuentos unidos en presencia de antígeno no marcado, B0 = recuentos unidos en ausencia de antígeno no marcado, ln = logaritmo natural
El cálculo logit se suele trazar en una escala lineal vs. el logaritmo de la concentración de analito. Es importante recordar que los radioisótopos son considerados peligrosos, y existen regulaciones estrictas en cuanto a su compra, uso, manejo y eliminación. Antes de realizar cualquier procedimiento radioisótopo, debes leer el manual de seguridad de tu institución. Su instructor revisará esta información con usted.
MATERIALES
Calculadora o tabla estadística capaz de realizar transformaciones de logaritmos naturales
PROCEDIMIENTO
- Utilizando la información proporcionada en la hoja de datos promedian los recuentos encuadernados para el estándar “0”. Esto es B 0.
- Promedio de los recuentos ligados (esto es B) para cada muestra y estándar.
- Calcular B/B 0, %B/B 0, 1-B/B 0, y luego logit B/B 0 para cada muestra.
- Trazar %B/B 0 (eje vertical) vs concentración de T4 de los estándares en la escala logarítmica (X, o eje horizontal) de la primera gráfica proporcionada.
- Trazar logit B/B 0 (eje vertical) vs concentración de T4 de los estándares en la escala logarítmica (eje X) de la segunda gráfica proporcionada.
- Determinar el valor de la concentración de T4 en lo desconocido (s) por interpolación a partir de ambas curvas estándar. Registro en la Ficha Técnica.
Preguntas de Discusión
- Si los recuentos enumerados en la ficha técnica para el estándar “0” (B 0) se contabilizaran en un minuto, ¿cuál sería la precisión de conteo? Si estos recuentos se acumularan durante un periodo de conteo de 10 minutos, ¿cambiaría la precisión?
- ¿Por qué la conversión logit se usa frecuentemente para la reducción de datos en ensayos de unión competitiva?
- ¿Qué porciones de la curva %B/B 0 son las más afectadas por la transformación logit? ¿Esto mejora la calidad del resultado?
- Se adquiere un vial de 125 I marcado T4 con una actividad de 10,000 cpm/\(\mu\) g (semivida = 2 meses). El ensayo no se realizó hasta 8 meses después. ¿Cuál es la actividad en ese momento?
| FICHA TÉCNICA, EJERCICIO #30 |
NOMBRE: ___________ FECHA: ___________ |
RESULTADOS
Datos del experimento:
| Muestra | Cpm | Cpm promedio | B/B 0 | 1-B/B 0 | Logit B/B 0 |
|---|---|---|---|---|---|
| Estándar T4 (\(\mu\)g/L) | |||||
| 0 (B 0) | 43285 41003 | ||||
| 25 | 37449 33274 | ||||
| 50 | 33107 30010 | ||||
| 100 | 23662 21976 | ||||
| 150 | 19583 19227 | ||||
| 300 | 14164 12808 |
| incógnitas | T4 calculado,\(\mu\) g/L | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 37448 35754 | \ (\ mu\) g/l"> | ||||
| 2 | 26867 24047 | \ (\ mu\) g/l"> | ||||
| 3 | 34174 33970 | \ (\ mu\) g/l"> | ||||
| 4 | 24427 24025 | \ (\ mu\) g/l"> | ||||
| 5 | 19331 17790 |
\ (\ mu\) g/l"> |
