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10.1: Clonación e Ingeniería Genética

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    La biotecnología es el uso de métodos artificiales para modificar el material genético de organismos vivos o células para producir nuevos compuestos o para realizar nuevas funciones. La biotecnología se ha utilizado para mejorar la ganadería y los cultivos desde el inicio de la agricultura a través de la cría selectiva. Desde el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953, y particularmente desde el desarrollo de herramientas y métodos para manipular el ADN en la década de 1970, la biotecnología se ha convertido en sinónimo de la manipulación del ADN de los organismos a nivel molecular. Las principales aplicaciones de esta tecnología son en la medicina (para la producción de vacunas y antibióticos) y en la agricultura (para la modificación genética de cultivos). La biotecnología también tiene muchas aplicaciones industriales, como la fermentación, el tratamiento de derrames de petróleo y la producción de biocombustibles, así como muchas aplicaciones domésticas como el uso de enzimas en detergentes para ropa.

    Manipulación de Material Genético

    Para lograr las aplicaciones descritas anteriormente, los biotecnólogos deben ser capaces de extraer, manipular y analizar ácidos nucleicos.

    Revisión de la Estructura del Ácido Nucleico

    Para comprender las técnicas básicas utilizadas para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas hechas de nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada). Los grupos fosfato en estas moléculas tienen cada uno una carga neta negativa. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo de organismos eucariotas se llama genoma. El ADN tiene dos cadenas complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas.

    A diferencia del ADN en las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El ARN mensajero (ARNm) se analiza con mayor frecuencia porque representa los genes codificadores de proteínas que se están expresando en la célula.

    Aislamiento de ácidos nucleicos

    Para estudiar o manipular los ácidos nucleicos, primero se debe extraer el ADN de las células. Se utilizan diversas técnicas para extraer diferentes tipos de ADN (Figura\(\PageIndex{1}\)). La mayoría de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos implican pasos para romper la célula y luego el uso de reacciones enzimáticas para destruir todas las macromoléculas no deseadas. Las células se abren por rotura usando una solución detergente que contiene compuestos amortiguadores. Para evitar la degradación y contaminación, macromoléculas como las proteínas y el ARN se inactivan usando enzimas. Luego se saca el ADN de la solución usando alcohol. El ADN resultante, al estar formado por polímeros largos, forma una masa gelatinosa.

    Se ilustran cuatro tubos de ensayo, mostrando cuatro pasos en la extracción de ADN. En la primera, las células se lisan usando un detergente que rompe la membrana plasmática. En el segundo, los contenidos celulares se tratan con proteasa para destruir la proteína, y RNasa para destruir el ARN. En el tercero, los desechos celulares se granulan en una centrífuga. El sobrenadante (líquido) que contiene el ADN se transfiere a un tubo limpio. En el cuarto tubo de ensayo, el ADN se precipita con etanol. Forma hebras viscosas que se pueden enrollar en una varilla de vidrio.
    Figura\(\PageIndex{1}\): Este diagrama muestra el método básico utilizado para la extracción de ADN.

    El ARN se estudia para comprender los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las enzimas que descomponen el ARN están comúnmente presentes en la naturaleza. Algunos incluso son secretados por nuestra propia piel y son muy difíciles de inactivar. Similar a la extracción de ADN, la extracción de ARN implica el uso de diversos tampones y enzimas para inactivar otras macromoléculas y preservar solo el ARN.

    Electroforesis en Gel

    Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o alcalino en un ambiente acuoso, pueden ser movidos por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar moléculas cargadas en función del tamaño y la carga. Los ácidos nucleicos pueden separarse como cromosomas completos o como fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura en un extremo de una matriz de gel, se aplica una corriente eléctrica y las moléculas cargadas negativamente se tiran hacia el extremo opuesto del gel (el extremo con el electrodo positivo). Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros en el gel más rápido que las moléculas más grandes; esta diferencia en la velocidad de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel son invisibles hasta que se tiñen con un compuesto que les permita ser vistos, como un colorante. Distintos fragmentos de ácidos nucleicos aparecen como bandas a distancias específicas de la parte superior del gel (el extremo negativo del electrodo) que se basan en su tamaño (Figura\(\PageIndex{2}\)). Una mezcla de muchos fragmentos de diferentes tamaños aparece como un frotis largo, mientras que el ADN genómico sin cortar suele ser demasiado grande para atravesar el gel y forma una sola banda grande en la parte superior del gel.

    La foto muestra un fondo negro con 9 bandas verticales grises tenues (carriles). En esas bandas se encuentran bandas horizontales blancas ligeramente borrosas de diferentes espesores y brillo. Los tenues carriles grises en los bordes izquierdo y derecho tienen muchas bandas horizontales, y los 7 en el medio tienen solo unas pocas cada una, en diferentes posiciones.
    Figura\(\PageIndex{2}\): Se muestran fragmentos de ADN de seis muestras ejecutadas en un gel, teñidas con un tinte fluorescente y vistas bajo luz UV. (crédito: modificación de obra de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

    Reacción en cadena de polimerasa

    El análisis de ADN a menudo requiere enfocarse en una o más regiones específicas del genoma. También frecuentemente involucra situaciones en las que solo una o unas pocas copias de una molécula de ADN están disponibles para su posterior análisis. Estas cantidades son insuficientes para la mayoría de los procedimientos, como la electroforesis en gel. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para aumentar rápidamente el número de copias de regiones específicas del ADN para análisis posteriores (Figura\(\PageIndex{3}\)). La PCR utiliza una forma especial de ADN polimerasa, la enzima que replica el ADN, y otras secuencias cortas de nucleótidos llamadas cebadores que se emparejan con una porción específica del ADN que se está replicando. La PCR se utiliza para muchos propósitos en laboratorios. Estos incluyen: 1) la identificación del dueño de una muestra de ADN dejada en la escena del crimen; 2) el análisis de paternidad; 3) la comparación de pequeñas cantidades de ADN antiguo con organismos modernos; y 4) determinar la secuencia de nucleótidos en una región específica.

    Figura que muestra la PCR en 4 etapas. Primero, la doble hebra de ADN se desnaturaliza a 95 grados Celsius para separar las hebras. Luego, las 2 hebras se hibridan a aproximadamente 50 grados Celsius usando cebadores. La ADN polimerasa luego extiende las nuevas hebras a 72 grados Celsius. El cuarto paso muestra que este procedimiento se lleva a cabo muchas veces, resultando en un incremento en las copias del ADN original.
    Figura\(\PageIndex{3}\): La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, se utiliza para producir muchas copias de una secuencia específica de ADN usando una forma especial de ADN polimerasa.

    Clonación

    En general, la clonación significa la creación de una réplica perfecta. Normalmente, la palabra se usa para describir la creación de una copia genéticamente idéntica. En biología, la recreación de un organismo completo se conoce como “clonación reproductiva”. Mucho antes de que se intentaran clonar un organismo completo, los investigadores aprendieron a copiar tramos cortos de ADN, un proceso que se conoce como clonación molecular.

    Clonación Molecular

    La clonación permite la creación de múltiples copias de genes, la expresión de genes y el estudio de genes específicos. Para obtener el fragmento de ADN en una célula bacteriana en una forma que se copiará o expresará, el fragmento se inserta primero en un plásmido. Un plásmido (también llamado vector en este contexto) es una pequeña molécula circular de ADN que se replica independientemente del ADN cromosómico en bacterias. En la clonación, las moléculas plasmídicas pueden usarse para proporcionar un “vehículo” en el que insertar un fragmento de ADN deseado. Los plásmidos modificados generalmente se reintroducen en un hospedador bacteriano para replicación. A medida que las bacterias se dividen, copian su propio ADN (incluidos los plásmidos). El fragmento de ADN insertado se copia junto con el resto del ADN bacteriano. En una célula bacteriana, el fragmento de ADN del genoma humano (u otro organismo que se esté estudiando) se denomina ADN extraño para diferenciarlo del ADN de la bacteria (el ADN huésped).

    Los plásmidos ocurren naturalmente en poblaciones bacterianas (como Escherichia coli) y tienen genes que pueden aportar rasgos favorables al organismo, como la resistencia a los antibióticos (la capacidad de no verse afectada por los antibióticos). Los plásmidos han sido altamente diseñados como vectores para la clonación molecular y para la posterior producción a gran escala de moléculas importantes, como la insulina. Una característica valiosa de los vectores plasmídicos es la facilidad con la que se puede introducir un fragmento de ADN extraño. Estos vectores plasmídicos contienen muchas secuencias cortas de ADN que pueden cortarse con diferentes enzimas de restricción comúnmente disponibles. Las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) reconocen secuencias de ADN específicas y las cortan de manera predecible; son producidas naturalmente por bacterias como mecanismo de defensa contra ADN extraño. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en las dos cadenas de ADN, de manera que los extremos cortados tienen un saliente monocatenario de 2 a 4 nucleótidos. La secuencia que es reconocida por la enzima de restricción es una secuencia de cuatro a ocho nucleótidos que es un palíndromo. Al igual que con una palabra palíndromo, esto significa que la secuencia lee lo mismo hacia adelante y hacia atrás. En la mayoría de los casos, la secuencia lee lo mismo hacia adelante en una hebra y hacia atrás en la cadena complementaria. Cuando se realiza un corte escalonado en una secuencia como esta, los voladizos son complementarios (Figura\(\PageIndex{4}\)).

    En la parte A, la figura muestra una hebra de ADN tipo escalera. En la parte B, el ADN se corta en ambas hebras entre las dos guaninas. En la parte C, las 2 cadenas se han separado, dejando extremos pegajosos complementarios en cada una con nucleótidos 5' a 3' G, A, T y C no unidos.
    Figura\(\PageIndex{4}\): En este (a) sitio de reconocimiento de enzima de restricción de seis nucleótidos, observe que la secuencia de seis nucleótidos lee lo mismo en la dirección 5' a 3' en una cadena que lo hace en la dirección 5' a 3' en la cadena complementaria. Esto se conoce como palíndromo. b) La enzima de restricción produce roturas en las cadenas de ADN, y c) el corte en el ADN da como resultado “extremos pegajosos”. Otra pieza de ADN cortada en cualquiera de los extremos por la misma enzima de restricción podría unirse a estos extremos pegajosos y ser insertada en el hueco hecho por este corte.

    Debido a que estos voladizos son capaces de volver a unirse por enlaces de hidrógeno con voladizos complementarios en un trozo de ADN cortado con la misma enzima de restricción, estos se llaman “extremos pegajosos”. El proceso de formación de enlaces de hidrógeno entre secuencias complementarias en cadenas simples para formar ADN bicatenario se denomina hibridación. La adición de una enzima llamada ADN ligasa, que participa en la replicación del ADN en las células, se une permanentemente a los fragmentos de ADN cuando los extremos pegajosos se unen. De esta manera, cualquier fragmento de ADN puede ser empalmado entre los dos extremos de un ADN plasmídico que ha sido cortado con la misma enzima de restricción (Figura\(\PageIndex{5}\)).

    Una ilustración que muestra los pasos para crear plásmidos de ADN recombinante, insertarlos en bacterias y luego seleccionar solo las bacterias que han absorbido con éxito el plásmido recombinante. Los pasos son los siguientes: tanto el ADN extraño como un plásmido se cortan con la misma enzima de restricción. El sitio de restricción ocurre solo una vez en el plásmido en medio de un gen para una enzima (lacZ). La enzima de restricción deja extremos pegajosos complementarios en el fragmento de ADN extraño y el plásmido. Esto permite que el ADN extraño se inserte en el plásmido cuando los extremos pegajosos se hibridan. La adición de ADN ligasa vuelve a conectar las cadenas principales de ADN. Estos son plásmidos recombinantes. Los plásmidos se combinan con un cultivo de bacterias vivas. Muchas de las bacterias no toman ningún plásmido en sus células, muchas toman plásmidos que no tienen el ADN extraño en ellas, y algunas toman el plásmido recombinante. Las bacterias que toman el plásmido recombinante no pueden producir la enzima a partir del gen en el que se insertó el fragmento (lacZ). También portan un gen de resistencia al antibiótico ampicilina, que estaba en el plásmido original. Para encontrar las bacterias con el plásmido recombinante, las bacterias se cultivan en una placa con el antibiótico ampicilina y una sustancia que cambia de color cuando se expone a la enzima producida por el gen lacZ. La ampicilina matará a cualquier bacteria que no tomara un plásmido. El color de la sustancia no cambiará cuando el gen para lacZ contenga el inserto de ADN extraño. Estas son las bacterias con el plásmido recombinante que queremos cultivar.
    Figura\(\PageIndex{5}\): Este diagrama muestra los pasos involucrados en la clonación molecular.

    Los plásmidos con ADN extraño insertado en ellos se denominan moléculas de ADN recombinante porque contienen nuevas combinaciones de material genético. Las proteínas que se producen a partir de moléculas de ADN recombinante se denominan proteínas recombinantes. No todos los plásmidos recombinantes son capaces de expresar genes. Los plásmidos también pueden diseñarse para expresar proteínas solo cuando son estimulados por ciertos factores ambientales, de manera que los científicos puedan controlar la expresión de las proteínas recombinantes.

    Clonación Reproductiva

    La clonación reproductiva es un método utilizado para hacer un clon o una copia idéntica de todo un organismo multicelular. La mayoría de los organismos multicelulares experimentan reproducción por medios sexuales, lo que implica el aporte del ADN de dos individuos (padres), haciendo imposible generar una copia idéntica o un clon de cualquiera de los progenitores. Los recientes avances en biotecnología han permitido clonar reproductivamente mamíferos en el laboratorio.

    La reproducción sexual natural implica la unión, durante la fecundación, de un espermatozoide y un óvulo. Cada uno de estos gametos es haploide, es decir, contienen un conjunto de cromosomas en sus núcleos. La célula resultante, o cigoto, es entonces diploide y contiene dos conjuntos de cromosomas. Esta célula se divide mitóticamente para producir un organismo multicelular. Sin embargo, la unión de dos células cualquiera no puede producir un cigoto viable; hay componentes en el citoplasma del óvulo que son esenciales para el desarrollo temprano del embrión durante sus primeras divisiones celulares. Sin estas disposiciones, no habría desarrollo posterior. Por lo tanto, para producir un nuevo individuo, se requiere tanto un complemento genético diploide como un citoplasma de huevo. El enfoque para producir un individuo clonado artificialmente es tomar el óvulo de un individuo y eliminar el núcleo haploide. Después se introduce en el óvulo un núcleo diploide de una célula corporal de un segundo individuo, el donante. Luego se estimula al huevo para que se divida para que el desarrollo avance. Esto suena simple, pero de hecho se necesitan muchos intentos antes de que cada uno de los pasos se complete con éxito.

    El primer animal agrícola clonado fue Dolly, una oveja que nació en 1996. La tasa de éxito de la clonación reproductiva en ese momento fue muy baja. Dolly vivió seis años y murió de un tumor pulmonar (Figura\(\PageIndex{6}\)). Se especuló que debido a que el ADN celular que dio origen a Dolly provenía de un individuo mayor, la edad del ADN pudo haber afectado su esperanza de vida. Desde Dolly, varias especies de animales (como caballos, toros y cabras) han sido clonadas con éxito.

    Ha habido intentos de producir embriones humanos clonados como fuentes de células madre embrionarias. En el procedimiento, el ADN de un humano adulto se introduce en un óvulo humano, que luego se estimula para que se divida. La tecnología es similar a la tecnología que se utilizó para producir Dolly, pero el embrión nunca se implanta en una madre sustituta. Las células producidas se llaman células madre embrionarias porque tienen la capacidad de desarrollarse en muchos tipos diferentes de células, como las células musculares o nerviosas. Las células madre podrían ser utilizadas para investigar y, en última instancia, proporcionar aplicaciones terapéuticas, como la sustitución de tejidos dañados. El beneficio de la clonación en esta instancia es que las células utilizadas para regenerar nuevos tejidos serían una combinación perfecta con el donante del ADN original. Por ejemplo, un paciente con leucemia no requeriría un hermano con una coincidencia de tejido para un trasplante de médula ósea.

    CONEXIÓN ART

    La ilustración muestra los pasos en la clonación de la oveja llamada Dolly. Un óvulo enucleado de una oveja se fusiona con una célula mamaria de otra oveja. Esta célula fusionada luego se divide a la etapa de blastocisto y se coloca en el útero de la oveja sustituta, donde se desarrolla en el cordero, Dolly. Dolly es el clon genético del donante de células mamarias.
    Figura\(\PageIndex{6}\): Dolly la oveja fue el primer animal agrícola en ser clonado. Para crear Dolly, se retiró el núcleo de un óvulo donante. El huevo enucleado se colocó junto a la otra celda, luego se les impactó para fusionarse. Se sorprendieron de nuevo al iniciar división. Se permitió que las células se dividieran durante varios días hasta alcanzar una etapa embrionaria temprana, antes de ser implantadas en una madre sustituta.

    ¿Por qué Dolly era una oveja Finn-Dorset y no una oveja escocesa Blackface?

    Ingeniería Genética

    El uso de la tecnología de ADN recombinante para modificar el ADN de un organismo para lograr rasgos deseables se llama ingeniería genética. La adición de ADN extraño en forma de vectores de ADN recombinante que se generan por clonación molecular es el método más común de ingeniería genética. Un organismo que recibe el ADN recombinante se denomina organismo genéticamente modificado (OGM). Si el ADN extraño que se introduce proviene de una especie diferente, el organismo huésped se llama transgénico. Las bacterias, las plantas y los animales han sido modificados genéticamente desde principios de la década de 1970 con fines académicos, médicos, agrícolas e industriales. Estas aplicaciones serán examinadas con más detalle en el siguiente módulo.

    CONCEPT EN ACCIÓN

    Código QR que representa una URL

    Mira este breve video explicando cómo los científicos crean un animal transgénico.

    Si bien los métodos clásicos de estudiar la función de los genes comenzaron con un fenotipo determinado y determinaron las bases genéticas de ese fenotipo, las técnicas modernas permiten a los investigadores comenzar a nivel de secuencia de ADN y preguntar: “¿Qué hace este gen o elemento de ADN?” Esta técnica, llamada genética inversa, ha dado como resultado revertir la metodología genética clásica. Un ejemplo de este método es análogo a dañar una parte del cuerpo para determinar su función. Un insecto que pierde un ala no puede volar, lo que significa que la función del ala es volar. El método genético clásico compara insectos que no pueden volar con insectos que pueden volar, y observa que los insectos no voladores han perdido alas. De manera similar, en un enfoque de genética inversa, mutar o eliminar genes proporciona a los investigadores pistas sobre la función génica. Como alternativa, la genética inversa puede usarse para hacer que un gen se sobreexprese a sí mismo para determinar qué efectos fenotípicos pueden ocurrir.

    Resumen

    Los ácidos nucleicos pueden aislarse de las células con fines de análisis adicionales rompiendo las células y destruyendo enzimáticamente todas las demás macromoléculas principales. Los cromosomas fragmentados o enteros se pueden separar en base al tamaño mediante electroforesis en gel. Los tramos cortos de ADN pueden amplificarse por PCR. El ADN se puede cortar (y posteriormente volver a empalmar) usando enzimas de restricción. Las técnicas moleculares y celulares de la biotecnología permiten a los investigadores diseñar genéticamente organismos, modificándolos para lograr rasgos deseables.

    La clonación puede implicar la clonación de pequeños fragmentos de ADN (clonación molecular), o la clonación de organismos completos (clonación reproductiva). En la clonación molecular con bacterias, se inserta un fragmento de ADN deseado en un plásmido bacteriano usando enzimas de restricción y el plásmido es captado por una bacteria, que luego expresará el ADN extraño. Usando otras técnicas, se pueden insertar genes extraños en organismos eucariotas. En cada caso, los organismos se denominan organismos transgénicos. En la clonación reproductiva, un núcleo donante se coloca en un óvulo enucleado, que luego se estimula para dividirse y desarrollarse en un organismo.

    En los métodos genéticos inversos, un gen es mutado o eliminado de alguna manera para identificar su efecto sobre el fenotipo de todo el organismo como una forma de determinar su función.

    Conexiones de arte

    Figura\(\PageIndex{6}\): ¿Por qué Dolly era una oveja Finn-Dorset y no una oveja escocesa Blackface?

    Responder

    Porque a pesar de que la célula original provenía de una oveja escocesa Blackface y la madre sustituta era una Blackface escocesa, el ADN provino de un Finn-Dorset.

    Glosario

    recocer
    en biología molecular, el proceso por el cual dos cadenas simples de hidrógeno de ADN se unen en nucleótidos complementarios para formar una molécula bicatenaria
    biotecnología
    el uso de métodos artificiales para modificar el material genético de organismos vivos o células para producir nuevos compuestos o para realizar nuevas funciones
    clonación
    la producción de una copia exacta, específicamente, una copia genética exacta, de un gen, célula u organismo
    electroforesis en gel
    una técnica utilizada para separar moléculas sobre la base de su capacidad de migrar a través de un gel semisólido en respuesta a una corriente eléctrica
    ingeniería genética
    alteración de la composición genética de un organismo mediante los métodos moleculares de la biotecnología
    organismo modificado genéticamente (OMG)
    un organismo cuyo genoma ha sido modificado artificialmente
    plásmido
    una pequeña molécula circular de ADN que se encuentra en bacterias que se replica independientemente del cromosoma bacteriano principal; los plásmidos codifican algunos rasgos importantes para las bacterias y pueden usarse como vectores para transportar ADN a bacterias en aplicaciones de ingeniería genética
    reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
    una técnica utilizada para hacer múltiples copias de ADN
    ADN recombinante
    una combinación de fragmentos de ADN generados por clonación molecular que no existe en la naturaleza
    proteína recombinante
    una proteína que se expresa a partir de moléculas de ADN recombinante
    enzima de restricción
    una enzima que reconoce una secuencia de nucleótidos específica en el ADN y corta la doble cadena de ADN en ese sitio de reconocimiento, a menudo con un corte escalonado que deja hebras simples cortas o extremos “pegajosos”
    genética inversa
    una forma de análisis genético que manipula el ADN para alterar o afectar el producto de un gen para analizar la función del gen
    clonación reproductiva
    clonación de organismos enteros
    transgénico
    describir un organismo que recibe ADN de una especie diferente

    Colaboradores y Atribuciones


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