5.13: Reparación de ADN

El ADN en la célula viva está sujeto a muchas alteraciones químicas (hecho que a menudo se olvida en la excitación de poder hacer secuenciación del ADN en especímenes secos y/o congelados). Si la información genética codificada en el ADN va a permanecer incorrupta, cualquier cambio químico debe ser corregido.

Una falla en la reparación del ADN produce una mutación.

La reciente publicación del genoma humano ya reveló 130 genes cuyos productos participan en la reparación del ADN. Probablemente pronto se identificarán más.

Agentes que dañan el ADN

• Ciertas longitudes de onda de radiación, incluida la radiación ionizante como los rayos gamma y los rayos X y los rayos ultravioleta, especialmente los rayos UV-C (~260 nm) que son absorbidos fuertemente por el ADN pero también los UV-B de longitud de onda más larga que penetra en el escudo de ozono.
• Radicales de oxígeno altamente reactivos producidos durante la respiración celular normal así como por otras vías bioquímicas.
• Químicos en el medio ambiente
  • muchos hidrocarburos, incluyendo algunos que se encuentran en el humo del cigarrillo
  • algunos productos vegetales y microbianos, por ejemplo las aflatoxinas producidas en cacahuetes mohosos
• Químicos utilizados en la quimioterapia, especialmente la quimioterapia de los cánceres

Tipos de Daño en el ADN

1. Las cuatro bases en el ADN (A, T, C, G) pueden modificarse covalentemente en diversas posiciones.
   • Una de las más frecuentes es la pérdida de un grupo amino (“desaminación”) -dando como resultado, por ejemplo, que una C se convierta en una U.
2. Desapareamientos de las bases normales debido a una falla en la corrección durante la replicación del ADN.
   • Ejemplo común: incorporación de la pirimidina U (normalmente encontrada solo en el ARN) en lugar de T.
3. Roturas en la columna vertebral.
   • Se puede limitar a una de las dos cadenas (una ruptura monocatenaria, SSB) o en ambas hebras (un d ouble- s tranded b reak (DSB). La radiación ionizante es una causa frecuente, pero algunos químicos también producen roturas.
4. Reticulación Se pueden formar enlaces covalentes entre bases
   • en la misma cadena de ADN (“intrahebra”) o
   • en la hebra opuesta (“interhebra”).
   Varios fármacos quimioterapéuticos utilizados contra los cánceres entrecruzan el ADN

Reparación de Bases Dañadas

Las bases dañadas o inapropiadas pueden ser reparadas por varios mecanismos:

• Reversión química directa del daño
• Reparación de Escisión, en la que se eliminan la base o bases dañadas y luego se reemplazan por las correctas en una ráfaga localizada de síntesis de ADN. Existen tres modos de reparación por escisión, cada uno de los cuales emplea conjuntos especializados de enzimas.
  1. Reparación de Escisión de Base (BER)
  2. Reparación de Escisión de Nucleótidos (NER)
  3. Reparación de desajustes (MMR)

El Premio Nobel de Química 2015 fue compartido por tres investigadores por su trabajo pionero en la reparación del ADN: Tomas Lindahl (BER), Aziz Sancar (NER) y Paul Modrich (MMR).

Reversión directa del daño base

Quizás la causa más frecuente de mutaciones puntuales en humanos es la adición espontánea de un grupo metilo (CH ₃ -) (un ejemplo de alquilación) a Cs seguido de desaminación a una T. Afortunadamente, la mayoría de estos cambios son reparados por enzimas, llamadas glicosilasas, que eliminan los desapareados T restaurando el C. Esto se hace sin la necesidad de romper el esqueleto del ADN (en contraste con los mecanismos de reparación por escisión descritos a continuación).

Algunos de los medicamentos utilizados en la quimioterapia contra el cáncer (“quimio”) también dañan el ADN por alquilación. Algunos de los grupos metilo pueden ser eliminados por una proteína codificada por nuestro gen MGMT. Sin embargo, la proteína sólo puede hacerlo una vez, por lo que la eliminación de cada grupo metilo requiere de otra molécula de proteína.

Esto ilustra un problema con los mecanismos de inversión directa de la reparación del ADN: son bastante derrochadores. Cada uno de los innumerables tipos de alteraciones químicas a las bases requiere de su propio mecanismo para corregirlo. Lo que necesita la célula son mecanismos más generales capaces de corregir todo tipo de daños químicos con una caja de herramientas limitada. Este requisito se cumple con los mecanismos de reparación por escisión.

Reparación de Escisión de Base (BER)

Los pasos y algunos actores clave:

1. remoción de la base dañada (¡se estima que ocurre unas 20,000 veces al día en cada célula de nuestro cuerpo!) por una ADN glicosilasa. Tenemos al menos 8 genes que codifican diferentes ADN glicosilasas, cada enzima responsable de identificar y eliminar un tipo específico de daño base.
2. eliminación de su fosfato de desoxirribosa en la cadena principal, produciendo un hueco. Tenemos dos genes que codifican enzimas con esta función.
3. reemplazo con el nucleótido correcto. Esto se basa en la ADN polimerasa beta, una de al menos 11 ADN polimerasas codificadas por nuestros genes.
4. ligadura de la rotura en la hebra. Se conocen dos enzimas que pueden hacer esto; ambas requieren ATP para proporcionar la energía necesaria.

Reparación de Escisión de Nucleótidos (NER)

La NER difiere de la BER en varias formas.

• Utiliza diferentes enzimas.
• A pesar de que puede haber una sola base “mala” para corregir, su nucleótido se elimina junto con muchos otros nucleótidos adyacentes; es decir, NER elimina un gran “parche” alrededor del daño.

Los pasos y algunos actores clave:

1. El daño es reconocido por uno o más factores proteicos que se ensamblan en la ubicación.
2. El ADN se desenrolla produciendo una “burbuja”. El sistema enzimático que hace esto es el Factor de Transcripción IIH, TFIIH, (que también funciona en la transcripción normal).
3. Se realizan cortes tanto en el lado 3' como en el lado 5' del área dañada para que se pueda eliminar el tracto que contiene el daño.
4. Una nueva ráfaga de síntesis de ADN, utilizando la cadena intacta (opuesta) como plantilla, rellena los nucleótidos correctos. Las ADN polimerasas responsables se denominan polimerasa delta y épsilon.
5. Una ligasa de ADN inserta covalentemente la pieza fresca en la cadena principal.

Xerodermia Pigmentosa (XP)

La XP es una rara enfermedad hereditaria del ser humano que, entre otras cosas, predispone al paciente a

• lesiones pigmentadas en áreas de la piel expuestas al sol y
• una elevada incidencia de cáncer de piel.

Resulta que la XP puede ser causada por mutaciones en uno cualquiera de varios genes —todos los cuales tienen papeles que desempeñar en la NER. Algunos de ellos:

• XPA, que codifica una proteína que se une al sitio dañado y ayuda a ensamblar las otras proteínas necesarias para la NER.
• XPB y XPD, que forman parte de TFIIH. Algunas mutaciones en XPB y XPD también producen signos de envejecimiento prematuro. [Enlace]
• XPF, que corta la columna vertebral en el lado 5' del daño
• XPG, que corta la columna vertebral en el lado 3'.

NER acoplado a transcripción

La reparación por escisión de nucleótidos procede más rápidamente en células cuyos genes se transcriben activamente en la cadena de ADN que sirve como molde para la transcripción. Esta mejora de la NER involucra XPB, XPD y varios otros productos génicos. Los genes para dos de ellos se denominan CSA y CSB (las mutaciones en ellos causan un trastorno hereditario llamado síndrome de Cockayne).

El producto CSB se asocia en el núcleo con la ARN polimerasa II, la enzima responsable de sintetizar el ARN mensajero (ARNm), proporcionando un vínculo molecular entre la transcripción y la reparación. Un escenario plausible: Si la ARN polimerasa II, rastreando a lo largo de la cadena molde (antisentido), encuentra una base dañada, puede reclutar otras proteínas, por ejemplo, las proteínas CSA y CSB, para hacer una solución rápida antes de que pase a completar la transcripción del gen.

Reparación de desajuste (MMR)

La reparación de desajustes se ocupa de corregir los desajustes de las bases normales; es decir, fallas en el mantenimiento del emparejamiento normal de bases Watson-Crick (A•T, C•G). Puede contar con la ayuda de enzimas involucradas tanto en la reparación de escisión de bases (BER) como en la reparación de escisión de nucleótidos (NER), así como en el uso de enzimas especializadas para esta función.

• El reconocimiento de un desapareamiento requiere varias proteínas diferentes, incluyendo una codificada por MSH2.
• Cortar el desajuste también requiere varias proteínas, incluyendo una codificada por MLH1.

Las mutaciones en cualquiera de estos genes predisponen a la persona a una forma heredada de cáncer de colon. Por lo que estos genes califican como genes supresores de tumores.

¿Cómo sabe el sistema MMR cuál es el nucleótido incorrecto?

En E. coli, ciertas adeninas se metilan poco después de que se haya sintetizado la nueva cadena de ADN. El sistema MMR funciona más rápidamente, y si detecta un desajuste, asume que el nucleótido en la cadena ya metilada (parental) es el correcto y elimina el nucleótido en la cadena hija recién sintetizada. Aún no se conoce cómo ocurre dicho reconocimiento en los mamíferos.

La síntesis del parche reparador se realiza mediante ADN polimerasa delta. Las células también usan el sistema MMR para mejorar la fidelidad de la recombinación; es decir, asegurar que solo las regiones homólogas de dos moléculas de ADN se emparejan para cruzar y recombinar segmentos (por ejemplo, en meiosis).

Reparación de roturas de hebra

La radiación ionizante y ciertos productos químicos pueden producir tanto roturas monocatenarias (SSB) como roturas bicatenarias (DSB) en la cadena principal del ADN.

Roturas de una sola hebra (SSB)

Las roturas en una sola cadena de la molécula de ADN se reparan utilizando los mismos sistemas enzimáticos que se utilizan en la Reparación de Escisión de Base (BER).

Roturas de doble hebra (DSB)

Existen dos mecanismos por los cuales la célula intenta reparar una ruptura completa en una molécula de ADN:

• Unión directa de los extremos rotos. Esto requiere proteínas que reconozcan y se unan a los extremos expuestos y los unan para ligarlos. Preferirían ver algunos nucleótidos complementarios pero pueden proceder sin ellos por lo que este tipo de unión también se llama Unión de extremos no homólogos (NHEJ). Una proteína llamada Ku es esencial para NHEJ. Ku es un heterodímero de las subunidades Ku70 y Ku80. Los errores en la unión directa pueden ser una causa de las diversas translocaciones que están asociadas con los cánceres. Algunos ejemplos incluyen el linfoma de Burkitt, el cromosoma Filadelfia en la leucemia mielógena crónica (LMC) y la leucemia de células B.
• Recombinación Homóloga (también conocida como Reparación Dirigida por Homología — HDR). Aquí los extremos rotos se reparan utilizando la información sobre la cromátida hermana intacta (disponible en G ₂ después de la duplicación cromosómica), o sobre el cromosoma homólogo (en G ₁; es decir, antes de que cada cromosoma tenga sido duplicado). Esto requiere buscar en el núcleo el homólogo, una tarea lo suficientemente incierta como para que las células G ₁ generalmente prefieran reparar sus DSB por NHEJ. o en el
• mismo cromosoma si hay copias duplicadas del gen en el cromosoma orientadas en direcciones opuestas (cabeza a cabeza o espalda con espalda).
• Dos de las proteínas utilizadas en la recombinación homóloga están codificadas por los genes BRCA1 y BRCA2. Las mutaciones heredadas en estos genes predisponen a las mujeres a los cánceres de mama y ovario.

La generación de diversidad de anticuerpos

Algunas de las mismas enzimas utilizadas para reparar los DSB mediante la unión directa también se utilizan para romper y volver a ensamblar los segmentos génicos utilizados para hacer

• regiones variables de anticuerpos; es decir, para lograr la unión V (D) J — (los ratones cuyos genes Ku80 han sido noqueados no pueden hacer esto);
• diferentes clases de anticuerpos; es decir, para lograr el cambio de clase

La meiosis también involucra DSB

La recombinación entre cromosomas homólogos en la meiosis I también implica la formación de DSB y su reparación. Por lo que no es de extrañar que en este proceso se utilicen las mismas enzimas.

La meiosis I con la alineación de secuencias homólogas proporciona un mecanismo para reparar el ADN dañado; es decir, mutaciones. De hecho, muchos biólogos sienten que la función principal del sexo es proporcionar este mecanismo para mantener la integridad del genoma.

Sin embargo, la mayoría de los genes en el cromosoma Y humano no tienen contraparte en el cromosoma X y, por lo tanto, no pueden beneficiarse de este mecanismo de reparación. Parecen resolver este problema al tener múltiples copias del mismo gen —orientadas en direcciones opuestas—. Looping el ADN intermedio une los duplicados y permite la reparación por recombinación homóloga.

Conversión de genes

Si la secuencia utilizada como molde para reparar un gen por recombinación homóloga difiere ligeramente del gen que necesita reparación; es decir, es un alelo, el gen reparado adquirirá la secuencia donante. Esta transferencia no recíproca de información genética se denomina conversión génica.

El donante de la nueva secuencia génica puede ser:

• el cromosoma homólogo (durante la meiosis)
• la cromátida hermana (también durante la meiosis)
• un duplicado del gen en el mismo cromosoma (durante la mitosis)

La conversión génica durante la meiosis altera las proporciones mendelianas normales. Normalmente, la meiosis en un progenitor heterocigótico (A, a) producirá gametos o esporas en una proporción 1:1; por ejemplo, 50% A; 50% a. Sin embargo, si se ha producido la conversión génica, aparecerán otras proporciones. Si, por ejemplo, un alelo A dona su secuencia ya que repara un alelo dañado, el gen reparado se convertirá en A, y la relación será 75% A; 25% a.

Quimioterapia del Cáncer

• El sello distintivo de todos los cánceres es la división celular continua.
• Cada división requiere tanto
  • la replicación del ADN de la célula (en fase S) y
  • transcripción y traducción de muchos genes necesarios para el crecimiento continuo.
• Entonces, cualquier químico que dañe el ADN tiene el potencial de inhibir la propagación de un cáncer.
• Muchos (pero no todos) los medicamentos utilizados para la terapia contra el cáncer hacen su trabajo al dañar el ADN.

La tabla enumera (tanto por nombre comercial como por nombre genérico) algunos de los medicamentos contra el cáncer que se dirigen específicamente al ADN.

6-mercaptopurina	Purinethol	análogo de purina. Un efecto: sustitutos de G, induciendo MMR abortiva y roturas de hebra
Gemcitabina	Gemzar	Sustitutos análogos de pirimidina para el alargamiento de la cadena bloqueante
Ciclofosfamida	Cytoxan	agentes alquilantes; formar entrecruzamientos interhebra y/o intrahebra
Melfalán	Alkeran
Busulfan	Myleran
Clorambucil	Leukeran
Mitomicina	Mutamycin®
Cisplatino	Platinol	formas de enlaces cruzados
Bleomicina	Blenoxano	corta cadenas de ADN entre GT o GC
Irinotecan	Camptosar	inhibir el correcto funcionamiento de las enzimas (topoisomerasas) necesarias para desenrollar el ADN para su replicación y transcripción
Mitoxantrona	Novantrone
Doxorubicina	Adriamycin
Dactinomicina	Cosmegen	se inserta en la doble hélice evitando que se desenrolle

El paciente con cáncer tiene muchos otros tipos celulares que también están proliferando rápidamente, por ejemplo, células del endotelio intestinal, médula ósea y folículos pilosos. Los medicamentos contra el cáncer también los dañan, produciendo muchos de los desagradables efectos secundarios de la “quimio”. Los agentes que dañan el ADN son ellos mismos cancerígenos, y la quimioterapia representa un riesgo significativo de crear un nuevo cáncer, a menudo una leucemia.