14.2: Estructura y Secuenciación del ADN

Habilidades para Desarrollar

• Describir la estructura del ADN
• Explicar el método de secuenciación de ADN de Sanger
• Discutir las similitudes y diferencias entre el ADN eucariota y procariota

Los bloques de construcción del ADN son los nucleótidos. Los componentes importantes del nucleótido son una base nitrogenada, desoxirribosa (azúcar de 5 carbonos) y un grupo fosfato (Figura\(\PageIndex{1}\)). El nucleótido se nombra dependiendo de la base nitrogenada. La base nitrogenada puede ser una purina como la adenina (A) y guanina (G), o una pirimidina como la citosina (C) y la timina (T).

Figura\(\PageIndex{1}\): Cada nucleótido está compuesto por un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada. El azúcar es desoxirribosa en el ADN y ribosa en el ARN.

Los nucleótidos se combinan entre sí mediante enlaces covalentes conocidos como enlaces fosfodiéster o enlaces. Las purinas tienen una estructura de doble anillo con un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros. Las pirimidinas son de menor tamaño; tienen una sola estructura de anillo de seis miembros. Los átomos de carbono del azúcar de cinco carbonos están numerados 1', 2', 3', 4' y 5' (1' se lee como “uno primo”). El residuo fosfato se une al grupo hidroxilo del carbono 5' de un azúcar de un nucleótido y al grupo hidroxilo del carbono 3' del azúcar del siguiente nucleótido, formando así un enlace fosfodiéster 5'-3'.

En la década de 1950, Francis Crick y James Watson trabajaron juntos para determinar la estructura del ADN en la Universidad de Cambridge, Inglaterra. Otros científicos como Linus Pauling y Maurice Wilkins también estaban explorando activamente este campo. Pauling había descubierto la estructura secundaria de las proteínas mediante cristalografía de rayos X. En el laboratorio de Wilkins, la investigadora Rosalind Franklin estaba usando métodos de difracción de rayos X para comprender la estructura del ADN. Watson y Crick fueron capaces de armar el rompecabezas de la molécula de ADN a partir de los datos de Franklin porque Crick también había estudiado la difracción de rayos X (Figura\(\PageIndex{2}\)). En 1962, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina. Desafortunadamente, para entonces Franklin había muerto, y los premios Nobel no se otorgan póstumamente.

Figura\(\PageIndex{2}\): El trabajo de científicos pioneros (a) James Watson, Francis Crick y Maclyn McCarty condujo a nuestra comprensión actual del ADN. La científica Rosalind Franklin descubrió (b) el patrón de difracción de rayos X del ADN, lo que ayudó a dilucidar su estructura de doble hélice. (crédito a: modificación de obra de Marjorie McCarty, Biblioteca Pública de Ciencia)

Watson y Crick propusieron que el ADN está compuesto por dos hebras que se tuercen una alrededor de la otra para formar una hélice diestra. El emparejamiento de bases tiene lugar entre una purina y una pirimidina; es decir, los pares A con pares T y G con C. La adenina y la timina son pares de bases complementarios, y la citosina y la guanina también son pares de bases complementarios. Los pares de bases se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno; la adenina y la timina forman dos enlaces de hidrógeno y la citosina y la guanina forman tres enlaces de hidrógeno. Las dos hebras son de naturaleza antiparalela; es decir, el extremo 3' de una hebra se enfrenta al extremo 5' de la otra hebra. El azúcar y el fosfato de los nucleótidos forman el esqueleto de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se apilan en su interior. Cada par de bases está separado del otro par de bases por una distancia de 0.34 nm, y cada giro de la hélice mide 3.4 nm. Por lo tanto, diez pares de bases están presentes por giro de la hélice. El diámetro de la doble hélice de ADN es de 2 nm, y es uniforme en todo. Solo el emparejamiento entre una purina y una pirimidina puede explicar el diámetro uniforme. La torsión de las dos hebras una alrededor de la otra da como resultado la formación de surcos mayores y menores uniformemente espaciados (Figura\(\PageIndex{3}\)).

Figura\(\PageIndex{3}\): El ADN tiene (a) una estructura de doble hélice y (b) enlaces fosfodiéster. Los (c) surcos mayores y menores son sitios de unión para proteínas de unión al ADN durante procesos como la transcripción (la copia de ARN a partir del ADN) y la replicación.

Técnicas de secuenciación de ADN

Hasta la década de 1990, la secuenciación del ADN (leyendo la secuencia del ADN) era un proceso relativamente costoso y largo. El uso de nucleótidos radiomarcados también agravó el problema a través de preocupaciones de seguridad. Con la tecnología actualmente disponible y las máquinas automatizadas, el proceso es barato, más seguro y se puede completar en cuestión de horas. Fred Sanger desarrolló el método de secuenciación utilizado para el proyecto de secuenciación del genoma humano, el cual es ampliamente utilizado hoy en día (Figura\(\PageIndex{4}\)).

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Visite este sitio para ver un video explicando la técnica de lectura de secuencias de ADN que resultó del trabajo de Sanger.

El método se conoce como el método de terminación de cadena didesoxídica. El método de secuenciación se basa en el uso de terminadores de cadena, los didesoxinucleótidos (ddNTPs). Los didesoxinucleótidos, o ddNTPSs, difieren de los desoxinucleótidos por la falta de un grupo OH 3' libre en el azúcar de cinco carbonos. Si se agrega un ddNTP a una cadena de ADN en crecimiento, la cadena no se extiende más porque el grupo OH 3' libre necesario para agregar otro nucleótido no está disponible. Mediante el uso de una proporción predeterminada de desoxirribonucleótidos a didesoxinucleótidos, es posible generar fragmentos de ADN de diferentes tamaños.

Figura\(\PageIndex{4}\): En el método de terminación de cadena didesoxídica de Frederick Sanger, se utilizan didesoxinucleótidos marcados con colorante para generar fragmentos de ADN que terminan en diferentes puntos. El ADN se separa por electroforesis capilar en base al tamaño, y del orden de los fragmentos formados, se puede leer la secuencia de ADN. La lectura de la secuencia de ADN se muestra en un electroferograma que es generado por un escáner láser.

La muestra de ADN a secuenciar se desnaturaliza o se separa en dos cadenas calentándola a altas temperaturas. El ADN se divide en cuatro tubos en los que se agrega un cebador, ADN polimerasa y los cuatro nucleótidos (A, T, G y C). Además de cada uno de los cuatro tubos, se agregan cantidades limitadas de uno de los cuatro didesoxinucleótidos a cada tubo respectivamente. Los tubos están etiquetados como A, T, G y C de acuerdo con el ddNTP agregado. Para fines de detección, cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos lleva un marcador fluorescente diferente. El alargamiento de la cadena continúa hasta que se incorpora un didesoxinucleótido fluorescente, después de lo cual no se produce ningún alargamiento adicional. Una vez terminada la reacción, se realiza electroforesis. Incluso se puede detectar una diferencia en la longitud de una sola base. La secuencia se lee desde un escáner láser. Por su trabajo en secuenciación de ADN, Sanger recibió el Premio Nobel de Química en 1980.

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La secuenciación del genoma de Sanger ha llevado a una carrera para secuenciar genomas humanos a una velocidad rápida y bajo costo, a menudo conocida como la secuencia de $1000 en un día. Conoce más seleccionando la animación Secuenciación a velocidad aquí.

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Por lo general, el gel está hecho de un químico llamado agarosa. Se agrega agarosa en polvo a un tampón y se calienta. Después de enfriar, la solución de gel se vierte en una bandeja de colada. Una vez que el gel se ha solidificado, se carga el ADN en el gel y se aplica corriente eléctrica. El ADN tiene una carga neta negativa y se mueve desde el electrodo negativo hacia el electrodo positivo. La corriente eléctrica se aplica durante el tiempo suficiente para dejar que el ADN se separe según el tamaño; los fragmentos más pequeños estarán más alejados del pozo (donde se cargó el ADN), y los fragmentos de peso molecular más pesados estarán más cerca del pozo. Una vez separado el ADN, el gel se tiñe con un tinte específico de ADN para su visualización (Figura\(\PageIndex{5}\)).

Figura\(\PageIndex{5}\): El ADN se puede separar en base al tamaño mediante electroforesis en gel. (crédito: James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

Conexión Evolutiva: Genoma Neandertal - ¿Cómo nos relacionamos?

El primer borrador de secuencia del genoma neandertal fue publicado recientemente por Richard E. Green et al. en 2010. ¹ Los neandertales son los antepasados más cercanos de los humanos actuales. Se sabía que vivían en Europa y Asia occidental antes de que desaparecieran de los registros fósiles hace aproximadamente 30 mil años. El equipo de Green estudió restos fósiles de casi 40 000 años que fueron seleccionados de sitios de todo el mundo. Se emplearon medios extremadamente sofisticados de preparación de muestras y secuenciación de ADN debido a la naturaleza frágil de los huesos y la fuerte contaminación microbiana. En su estudio, los científicos pudieron secuenciar unos cuatro mil millones de pares de bases. La secuencia neandertal se comparó con la de los humanos actuales de todo el mundo. Después de comparar las secuencias, los investigadores encontraron que el genoma neandertal tenía de 2 a 3 por ciento mayor similitud con las personas que viven fuera de África que con las personas en África. Si bien las teorías actuales han sugerido que todos los humanos actuales pueden rastrearse hasta una pequeña población ancestral en África, los datos del genoma neandertal pueden contradecir esta visión. Green y sus colegas también descubrieron segmentos de ADN entre personas en Europa y Asia que son más similares a las secuencias neandertales que a otras secuencias humanas contemporáneas. Otra observación interesante fue que los neandertales están tan estrechamente relacionados con personas de Papúa Nueva Guinea como con los de China o Francia. Esto es sorprendente porque los restos fósiles de neandertales se han localizado sólo en Europa y Asia Occidental. Lo más probable es que el intercambio genético tuvo lugar entre los neandertales y los humanos modernos a medida que los humanos modernos surgieron de África, antes de la divergencia de europeos, asiáticos orientales y papúa Nueva Guinea.

Varios genes parecen haber sufrido cambios de los neandertales durante la evolución de los humanos actuales. Estos genes están involucrados en la estructura craneal, el metabolismo, la morfología de la piel y el desarrollo cognitivo. Uno de los genes que es de particular interés es RUNX2, que es diferente en humanos modernos y neandertales. Este gen es responsable del hueso frontal prominente, la caja torácica en forma de campana y las diferencias dentales observadas en los neandertales. Se especula que un cambio evolutivo en RUNX2 fue importante en el origen de los humanos modernos, y esto afectó el cráneo y la parte superior del cuerpo.

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Mira la charla de Svante Pääbo explicando la investigación del genoma neandertal en la conferencia anual TED (Tecnología, Entretenimiento, Diseño) 2011.

Envasado de ADN en células

Al comparar células procariotas con células eucariotas, los procariotas son mucho más simples que los eucariotas en muchas de sus características (Figura\(\PageIndex{6}\)). La mayoría de los procariotas contienen un solo cromosoma circular que se encuentra en una zona del citoplasma llamada nucleoide.

Figura\(\PageIndex{6}\): Un eucariota contiene un núcleo bien definido, mientras que en los procariotas, el cromosoma se encuentra en el citoplasma en una zona llamada nucleoide.

Ejercicio\(\PageIndex{1}\)

En las células eucariotas, la síntesis de ADN y ARN ocurre en un compartimento separado de la síntesis de proteínas. En las células procariotas, ambos procesos ocurren juntos. ¿Qué ventajas podría tener separar los procesos? ¿Qué ventajas podría haber de que ocurran juntos?

Contestar

La compartimentación permite que una célula eucariota divida los procesos en pasos discretos para que pueda construir proteínas y productos de ARN más complejos. Pero también hay una ventaja en tener un solo compartimento: la síntesis de ARN y proteínas ocurre mucho más rápidamente en una célula procariota.

El tamaño del genoma en uno de los procariotas más estudiados, E. coli, es de 4.6 millones de pares de bases (aproximadamente 1.1 mm, si se corta y se estira). Entonces, ¿cómo encaja esto dentro de una pequeña célula bacteriana? El ADN está retorcido por lo que se conoce como superenrollamiento. Superenrollado significa que el ADN está subenrollado (menos de una vuelta de la hélice por 10 pares de bases) o sobre-enrollado (más de 1 vuelta por 10 pares de bases) desde su estado relajado normal. Se sabe que algunas proteínas están involucradas en el superenrollamiento; otras proteínas y enzimas como la ADN girasa ayudan a mantener la estructura superenrollada.

Los eucariotas, cuyos cromosomas consisten cada uno en una molécula de ADN lineal, emplean un tipo diferente de estrategia de empaquetamiento para ajustar su ADN dentro del núcleo (Figura\(\PageIndex{7}\)). En el nivel más básico, el ADN se envuelve alrededor de proteínas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas son proteínas conservadas evolutivamente que son ricas en aminoácidos básicos y forman un octámero. El ADN (que está cargado negativamente debido a los grupos fosfato) se envuelve firmemente alrededor del núcleo de histona. Este nucleosoma se vincula al siguiente con la ayuda de un ADN enlazador. Esto también se conoce como la estructura de “cuentas en una cuerda”. Esta se compacta adicionalmente en una fibra de 30 nm, que es el diámetro de la estructura. En la etapa de metafase, los cromosomas están en su forma más compacta, tienen aproximadamente 700 nm de ancho y se encuentran asociados con proteínas andamios.

En interfase, los cromosomas eucariotas tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción. La región estrechamente empaquetada se conoce como heterocromatina, y la región menos densa se conoce como eucromatina. La heterocromatina suele contener genes que no se expresan, y se encuentra en las regiones del centrómero y los telómeros. La eucromatina suele contener genes que se transcriben, con ADN empaquetado alrededor de nucleosomas pero no compactado más.

Figura\(\PageIndex{7}\): Estas figuras ilustran la compactación del cromosoma eucariota.

Resumen

El modelo actualmente aceptado de la estructura de doble hélice del ADN fue propuesto por Watson y Crick. Algunas de las características sobresalientes son que las dos hebras que componen la doble hélice son de naturaleza complementaria y antiparalela. Los azúcares y fosfatos de desoxirribosa forman la columna vertebral de la estructura, y las bases nitrogenadas se apilan en su interior. El diámetro de la doble hélice, 2 nm, es uniforme en todas partes. Una purina siempre se empareja con una pirimidina; A se empareja con T y G con C. Una vuelta de la hélice tiene diez pares de bases. Durante la división celular, cada célula hija recibe una copia del ADN mediante un proceso conocido como replicación del ADN. Los procariotas son mucho más simples que los eucariotas en muchas de sus características. La mayoría de los procariotas contienen un solo cromosoma circular. En general, los cromosomas eucariotas contienen una molécula de ADN lineal empaquetada en nucleosomas, y tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción, reflejando diferentes estados de empaquetamiento y compactación.

Notas al pie

1. 1 Richard E. Green et al., “Un borrador de secuencia del genoma neandertal”, Science 328 (2010): 710-22.

Glosario

electroforesis

técnica utilizada para separar fragmentos de ADN de acuerdo al tamaño