9.8: Electroforesis
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Enfoque isoeléctrico
Las proteínas varían considerablemente en sus cargas y, consecuentemente, en sus valores de pI (pH al que su carga es cero). La separación de proteínas mediante enfoque isoeléctrico requiere el establecimiento de un gradiente de pH en una matriz de gel de acrilamida. Los poros de la matriz se ajustan para que sean grandes para reducir el efecto del tamizado en función del tamaño. Las moléculas a enfocar se aplican al gel con el gradiente de pH y se pasa una corriente eléctrica a través del mismo. Las moléculas cargadas positivamente, por ejemplo, se mueven hacia el electrodo negativo, pero como están viajando por un gradiente de pH, a medida que pasan por él, alcanzan una región donde su carga es cero y, en ese punto, dejan de moverse. En ese punto no se sienten atraídos por el electrodo positivo ni el negativo y, por lo tanto, son “enfocados” en su pI. Mediante el uso de enfoque isoeléctrico, es posible separar proteínas cuyos valores de pI difieren en tan solo 0.01 unidades.
Electroforesis en Gel 2-D
Tanto el SDS-PAGE como el enfoque isoeléctrico son técnicas poderosas, pero una combinación inteligente de las dos es una poderosa herramienta de proteómica, la ciencia de estudiar todas las proteínas de una célula/tejido simultáneamente. En electroforesis en gel 2D, primero se prepara un extracto que contiene las proteínas. Uno podría, por ejemplo, estar estudiando las proteínas del tejido hepático. Las células hepáticas se lisan y todas las proteínas se recogen en una muestra. A continuación, la muestra se somete a isoelectroenfoque como se describió anteriormente, para separar las proteínas por sus valores de pI. A continuación, como se muestra en la página anterior, el gel isoeléctrico que contiene las proteínas separadas se gira 90º y se coloca encima de un gel de poliacrilamida regular para análisis SDS-PAGE (para separarlas en función del tamaño). Las proteínas en la matriz de gel isoeléctrico se someten a electroforesis en el gel de poliacrilamida y se realiza la separación en base al tamaño. El producto de este análisis es un gel 2D, en el que las proteínas se clasifican tanto por masa como por carga.
El poder de la electroforesis en gel 2D es que prácticamente todas las proteínas de una célula pueden separarse y aparecer en el gel como un punto distinto. En la figura, las manchas en la parte superior izquierda corresponden a proteínas grandes con carga positiva, mientras que las de la parte inferior derecha son pequeñas con carga negativa. Es posible usar análisis de espectrometría de masas de alto rendimiento para identificar cada punto en un gel 2D. Esto es particularmente poderoso cuando se comparan perfiles de proteínas entre diferentes tejidos o entre las muestras del mismo tejido tratadas o no tratadas con un medicamento en particular. La comparación de una separación 2D de un tejido no canceroso con un tejido canceroso del mismo tipo proporciona una identificación rápida de proteínas cuyo nivel de expresión difiere entre ellas. Información como esta podría ser útil en el diseño de tratamientos o para determinar los mecanismos por los cuales surgió el cáncer.