9: Técnicas
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El ambiente de una célula es muy complejo, lo que hace que sea muy difícil, si no imposible, estudiar reacciones individuales, enzimas o vías dentro de ella. Por esta razón, los bioquímicos prefieren aislar moléculas (enzimas, ADN, ARN, y otras moléculas de interés) para que puedan analizarse sin interferencias de los millones de otros procesos que ocurren simultáneamente en la célula. Muchos de los métodos utilizados para aislar moléculas de células implican alguna forma de cromatografía. Para separar los compuestos de sus entornos celulares, primero hay que romper (lisar) las células. En esta sección, describimos algunos de los métodos que utilizan los bioquímicos para realizar su trabajo.
- 9.1: Interrupción celular
- Hay varias formas de romper celdas abiertas. Cualquiera que sea el método que se emplee, los lisados crudos obtenidos contienen todas las moléculas en la célula y, por lo tanto, deben procesarse adicionalmente para separar las moléculas en subconjuntos o fracciones más pequeños.
- 9.2: Fraccionamiento
- El fraccionamiento de las muestras normalmente comienza con centrifugación. Usando una centrífuga, se pueden eliminar los desechos celulares y fraccionar los orgánulos y el citoplasma. Por ejemplo, los núcleos, al ser relativamente grandes, pueden ser girados a velocidades bastante bajas. Una vez sedimentados los núcleos, la solución restante, o sobrenadante, se puede centrifugar a velocidades más altas para obtener los orgánulos más pequeños, como las mitocondrias. Cada una de estas fracciones contendrá un subconjunto de las moléculas en la célula.
- 9.3: Cromatografía de intercambio iónico
- En la cromatografía de intercambio iónico, el soporte consiste en diminutas perlas a las que se unen sustancias químicas que poseen una carga. Cada molécula cargada tiene un contra-ión.
- 9.4: Cromatografía de exclusión en gel
- La cromatografía de exclusión en gel es un método de aislamiento de baja resolución. Esto implica el uso de cuentas que tienen pequeños “túneles” en ellas que cada una tiene un tamaño preciso. El tamaño se conoce como un “límite de exclusión”, lo que significa que las moléculas por encima de cierto peso molecular no encajarán en los túneles. Las moléculas con tamaños mayores que el límite de exclusión no ingresan a los túneles y pasan a través de la columna relativamente rápido abriéndose paso entre las perlas.
- 9.5: Cromatografía de afinidad
- La cromatografía de afinidad explota las afinidades de unión de las moléculas diana (típicamente proteínas) por sustancias unidas covalentemente a perlas. Por ejemplo, si se quisiera separar todas las proteínas en una muestra que se unían a ATP de las proteínas que no se unen al ATP, se podría unir covalentemente ATP a perlas de soporte y luego pasar la muestra a través de la columna. Todas las proteínas que se unan al ATP se “pegarán” a la columna, mientras que las que no se unan al ATP pasarán rápidamente a través de ella.
- 9.7: Etiquetado de histidina
- El etiquetado de histidina es una herramienta poderosa para aislar una proteína recombinante de un lisado celular. La proteína producida cuando se expresa este gen tiene una serie de residuos de histidina fusionados en el extremo carboxilo o amino a los aminoácidos en el resto de la proteína. Las cadenas laterales de histidina de esta “etiqueta” tienen afinidad por iones níquel o cobalto, lo que hace que la separación de las proteínas etiquetadas con histidina de un lisado celular sea relativamente fácil.
- 9.8: Electroforesis
- Las moléculas de ADN son largas y están cargadas de cargas negativas, gracias a sus cadenas principales de fosfato. Los métodos electroforéticos separan moléculas grandes, como ADN, ARN y proteínas en función de su carga y tamaño. Para ADN y ARN, la carga del ácido nucleico es proporcional a su tamaño (longitud). Para las proteínas, que no tienen una carga uniforme, se emplea un truco inteligente para hacerlas imitar a los ácidos nucleicos.
- 9.10: Microarrays
- Las micromatrices de ADN, por ejemplo, pueden usarse para determinar todos los genes que se están expresando en un tejido dado, simultáneamente. Las micromatrices emplean una cuadrícula (o matriz) hecha de filas y columnas en un portaobjetos de vidrio, con cada caja de la cuadrícula conteniendo muchas copias de una molécula específica, digamos una molécula de ADN monocatenario correspondiente a la secuencia de un solo gen único.