6.1: Transformación genética (usando bacterias y el plásmido pGlo)

La transformación genética es el proceso por el cual un organismo adquiere y expresa un nuevo gen. La ingeniería genética es la transferencia dirigida de un gen, o fragmento de ADN, a una célula (típicamente una bacteria). Por lo general, la intención es forzar a la célula a expresar (producir) la proteína que codifica la pieza de ADN recién introducida (conocida como expresión heteróloga). El organismo comúnmente utilizado para la transformación genética y la expresión heteróloga de genes/proteínas humanas es la bacteria unicelular conocida como Escherichia coli (E. coli). Este organismo tiene varios rasgos de importancia en el laboratorio:

• Organismo unicelular
• El tiempo de duplicación es de 20 minutos (en medios enriquecidos) a 1 hora (medios mínimos)
• Vive naturalmente en el intestino humano (parte de la flora intestinal normal). Por lo tanto, la temperatura de crecimiento normal es de 37 °C (temperatura corporal humana)
• E. coli tiene un solo cromosoma que es una molécula de ADN circular
• E. coli es gram negativa - tiene una membrana citosólica interna, espacio periplásmico y membrana celular externa

Figura 6.1.1: Genoma de E. coli

El ADN extraño se puede introducir en la E. coli como un segundo “cromosoma”, o como otra molécula circular de ADN que puede replicarse de forma autónoma debido a tener su propio origen de replicación. Tales “elementos que se replican autónomamente” se denominan "plásmidos"” o "vectores”.”

Figura 6.1.2: Plasmido en E. coli

Para "retener establemente" el plásmido, es necesario que haya algún tipo de razón metabólica para que E. coli mantenga el plásmido alrededor. Si el plásmido contiene un gen que codifica para una proteína que protege contra los antibióticos, entonces, solo las células que tienen el plásmido sobrevivirán en presencia de ese antibiótico. Por lo tanto, la resistencia a fármacos puede formar la base de un "marcador seleccionable" para la presencia del plásmido en una muestra de E. coli. La ampicilina es un antibiótico para células gram negativas como E. coli (forma parte de la familia de antibióticos de la penicilina):

• Se inhibe la producción de la estructura de membrana celular/proteoglicano externa En presencia de ampicilina (un evento letal para la bacteria)
• La ampicilina, como molécula, contiene una estructura de anillo b -lactama. Este anillo puede ser escindido (y la ampicilina destruida) por la enzima b-lactamasa
• La enzima b-lactamasa es el producto del gen bla (los genes son típicamente minúsculas y cursivas)
• Si un plásmido contiene el gen bla, conferirá resistencia a la ampicilina al hospedador E. coli
• Dicha E. coli cultivada en presencia de ampicilina será seleccionada para. Bajo estas condiciones, cualquier E. coli de tipo silvestre en la muestra se seleccionará contra)
• Por lo tanto, la resistencia a la ampicilina es un marcador seleccionable para el plásmido

Figura 6.1.3: Plasmido de resistencia a ampicilina

Otros genes (que expresan otras proteínas) ahora se pueden introducir en el plásmido, y el huésped E. coli obligado a expresar la proteína de interés

PgLo

Los plásmidos suelen abreviarse con un acrónimo que comienza con la minúscula “p”, y el nombre puede proporcionar alguna información sobre la persona que diseñó el plásmido, o el contenido del plásmido. El plásmido pGlo contiene un origen o replicación, un marcador seleccionable y el gen para la Proteína Verde Fluorescente (GFP). El plásmido también contiene un gen para la proteína arabinosa C, que es una proteína que regula la expresión del promotor de arabinosa BAD (P _BAD). Los promotores suelen indicarse con un acrónimo que comienza con una “P” mayúscula.

Figura 6.1.4: plásmido pGlo. El ori es el origen de la replicación para el plásmido pGlo, bla es el gen que codifica para b-lactamasa, y es el marcador seleccionable resistente a fármacos para el plásmido, GFP es el gen GFP y araC es el gen que codifica para la proteína arabinosa C

Un "promotor"” es una región de ADN que señala a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción (para la producción de ARNm). Los promotores se localizan típicamente en el inicio (extremo 5') de un gen que codifica para una proteína (ya que la producción de ARNm procede 5'->3'). El gen bla incluye un promotor en el extremo 5' del gen. Este es un promotor constitutivo débil (siempre “encendido” a un nivel bajo). Se instruirá a la ARN polimerasa para hacer continuamente un bajo nivel de ARNm para este gen. El ARNm se traducirá para producir niveles bajos de la proteína b-lactamasa. La GFP es transcrita por el promotor arabinosa P _BAD. Este es un promotor fuerte y provocará que la ARN polimerasa haga un gran número de copias de ARNm a partir de este gen (y por lo tanto, mucha proteína GFP). Sin embargo, el promotor _BAD de arabinosa P está regulado por la proteína codificada por el gen araC (que tiene su propio promotor, muy parecido al gen bla):

• En ausencia del azúcar arabinosa, la proteína AraC se une al promotor PBAD e impide la transcripción (de GFP)
• En presencia de arabinosa en solución, la proteína AraC se une a la arabinosa, y esto da como resultado un cambio conformacional a la proteína AraC, cuyo resultado es que ahora instruye a la ARN polimerasa a hacer muchas copias de la ARNm de GFP (y por lo tanto, mucha proteína GFP)

¿Cómo se introduce el plásmido pGlo en la célula de E. coli?

El proceso general por el cual se introduce el ADN extraño en una célula se llama transformación. Hay varias formas de transformar el ADN en una célula de E. coli, pero la forma más común es haciendo que las células sean competentes. Las células “competentes” tienen la capacidad de captar moléculas de ADN del medio ambiente. Las E. coli normales no son competentes, sin embargo, si son tratadas con una solución de cloruro de calcio sus membranas celulares se vuelven competentes. En realidad, solo una pequeña fracción de las células tratadas con CaCl ₂ son capaces de tomar ADN extraño, sin embargo, dado que el número de células en una muestra es grande, la baja eficiencia de transformación no es un gran problema. Los marcadores seleccionables aseguran que solo las células que tomaron el ADN extraño (es decir, el plásmido) sobrevivirán y crecerán.

Figura 6.1.5: Transformación de E. Coli

Expresión de GFP

La adición de azúcar arabinosa a los medios de crecimiento hará que la ARN polimerasa comience a transcribir el gen GFP (es decir, hacer moléculas de ARNm). La maquinaria celular (por ejemplo, ribosomas) traducirá este ARNm en la proteína GFP correspondiente.

• GFP fluorescerá verde bajo luz UV
• La presencia de luz verde de células de E. coli indica que la transformación (y selección de resistencia a fármacos) ha sido exitosa
• GFP es un gen de una medusa y es la razón por la que algunas medusas brillan de color verde. No es un gen normal para E. coli, sin embargo, si se introduce en E. coli, hará que la proteína GFP (y fluoresce verde)