1.16: El sabor de la genética - Catador PTC

Objetivos de aprendizaje

Objetivos:

• Comprender la PCR básica y la electroforesis en gel
• Comprender la detección básica de mutaciones en el ADN
• Aprender cómo se incorporan las enzimas de restricción en la biotecnología

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Comprender los SNP
• Saber cómo realizar una extracción de ADN, PCR y digestión de restricción
• Saber interpretar un gel de ADN después de la electroforesis

Introducción

Cada organismo de la Tierra tiene una manera diferente de percibir el mundo debido a sus experiencias de vida individuales así como a su composición genética. Los humanos no son diferentes; cada individuo tiene sus propias experiencias que dan forma a su percepción del mundo pero también lo hace su ADN. Te sorprenderá saber que el 99.9% del genoma humano es idéntico de un individuo a otro, y es la diferencia de 0.1% lo que hace que cada individuo sea único.

Algunas de estas diferencias pueden afectar a nuestros sistemas sensoriales y a cómo percibimos el mundo natural. Por ejemplo, con el tiempo hemos aprendido qué cosas saben bien y son buenas para nosotros mientras simultáneamente aprendemos qué cosas saben mal o son malas para nosotros. Específicamente, los compuestos amargos están estrechamente asociados a sustancias tóxicas en la naturaleza. La forma en que sabemos que las cosas tienen un sabor amargo, o cualquier otro sabor para el caso, es porque tenemos receptores químicos especiales en nuestra boca y nariz que unen moléculas en nuestros alimentos y envían señales al cerebro diciéndole a qué sabe la comida.

Figura 1: Un producto químico que se fija a un receptor de membrana

Un tipo de receptor amargo en nuestra boca detecta la presencia de un químico llamado feniltiocabamida, o PTC. El PTC es un químico no tóxico pero se parece mucho a los compuestos tóxicos que a menudo se encuentran en los alimentos. ¡Lo único de PTC es que no todos pueden probarlo! Esto lo aprendimos por primera vez en la década de 1920 cuando Arthur L. Fox y C. R. Noller estaban trabajando con polvo PTC y Noller se quejó del sabor extremadamente amargo mientras que Fox no sabía nada en absoluto. Esto llevó a la experimentación donde los científicos finalmente descubrieron que la capacidad de probar PTC era hereditaria; ¡estaba en nuestro ADN!

Antes de hablar sobre la genética de la degustación PTC, primero necesitamos entender alguna terminología. El rasgo observable, como la capacidad de saborear PTC, se denomina fenotipo. La información genética que codifica para ese fenotipo se denomina genotipo. Los genes que componen un genotipo provienen de los padres en forma de alelos; un alelo de la madre y un alelo del padre. Las dos copias pueden ser el mismo alelo, homocigóticas, o las dos copias pueden ser diferentes, heterocigóticas.

La capacidad de probar PTC proviene del gen TAS2R38 que codifica uno de los receptores químicos en nuestra boca que se une a PTC. Al comparar catadores PTC con no catadores, los científicos han encontrado tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que diferencian el alelo catador (T) del alelo no gustativo (t). Un SNP es una mutación genética donde un nucleótido en el ADN es diferente de un individuo a otro. La palabra mutación suena aterradora pero una mutación no siempre es mala; hay casi 10 millones de SNP en humanos lo que significa que los SNP son comunes. Los tres SNP (ver tabla 1) que se encuentran en el gen TAS2R38 conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos que potencialmente pueden cambiar la función de las proteínas.

Cuadro 1. SNPs Presentes en Catadores vs No Catadores para PTC

Posición del nucleótido (pb)	Cambio de Nucleótidos		Cambio de codón		Cambio de Aminoácidos
	fenotipo	No Catador	Catador	No catador	Catador	No catador	Catador
145	G	C	G CA	C CA	Alanina	Prolina
785	T	C	G T T	G C T	Valina	Alanina
886	A	G	Un TC	G TC	Isoleucina	Valina

Antes de que descubras tu capacidad de degustación, primero entendamos la genética de los alelos. Los individuos que son catadores pueden ser TT (homocigotos dominantes) o Tt (heterocigóticos). Los individuos que no son catadores siempre serán tt (homocigotos recesivos). Para entender cómo se heredan los genes, examine la tabla 2 a continuación donde se analiza la descendencia potencial de dos progenitores heterocigóticos. Hay un 75% de probabilidad de tener hijos que son catadores para PTC y un 25% de probabilidad de tener hijos que no son catadores.

Cuadro 2. Patrón de herencia de muestra para degustación PTC

Alelos Padres	T	t
T	TT (catador homocigótico)	Tt (catador heterocigótico)
t	Tt (catador heterocigótico)	tt (no catador homocigótico)

Descubriremos su genotipo hoy usando tres ensayos muy comúnmente utilizados en el campo de la biotecnología. La primera es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se utiliza para amplificar selectivamente una región específica de ADN de interés. La PCR nos permite tomar una o dos copias de ADN y hacer millones de ellas facilitando el análisis de los resultados. Después realizaremos una digestión de restricción con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son como “tijeras moleculares” porque cortan el ADN en secuencias de nucleótidos específicas llamadas sitios de reconocimiento. Para este laboratorio, se utilizará la enzima de restricción llamada HaelIII, que reconoce la secuencia GGCC. Cuando HaelIII se encuentra con la secuencia de reconocimiento, la enzima cortará el ADN entre los nucleótidos G y C produciendo dos cadenas de ADN de diferentes tamaños. Para visualizar el ADN, realizaremos electroforesis en gel, nuestro tercer ensayo, que nos permite separar las moléculas de ADN en función de su tamaño. Consulte la Figura 2 a continuación para conocer los resultados esperados.

Figura 2:. Resultados esperados de electroforesis en gel post-digestión de restricción

Parte I: Día 1

Materiales

Figura 3. Reactivos Día 1

Reactivos

• Papel PTC
• Tubos pequeños de microcentrífuga/PCR
• Solución salina al 0.9%
• Solución de extracción
• Mezcla Maestra Taq
• Mezcla de imprimación

Equipo

• Micropipetas P-20 y P-200 y puntas desechables
• Microcentrífuga
• Termociclador o baño de agua a 95 ^o C
• Cubeta de hielo o termociclador programado
• Congelador -20 ^o C

Procedimiento (según las directrices del fabricante)

1. Coloca una tira de papel PTC en la punta de la lengua y registra si tiene un sabor amargo o no. Desechar el papel PTC usado en residuos biológicos
   • Amargo
   • No amargo
2. Contar a los alumnos de la clase para determinar el número de catadores y no catadores y colocar esa información en el recuadro siguiente:

Cuadro 3. Datos de clase

Fenotipos	Número de alumnos	% Total
Catador PTC
PTC No Catador
Total

3. Marque 2 tubos de PCR y una taza de solución salina con su propio identificador
4. Vierte la solución salina al 0.9% en tu boca y sacude vigorosamente durante 2 minutos para desalojar las células en tu boca. De aquí es de donde vendrá el ADN en nuestro experimento.
5. Pipetee 200 µL de su mezcla de saliva/solución salina en uno de los tubos de PCR etiquetados (tubo de microcentrífuga pequeño) y cierre el tubo de PCR firmemente.
6. Centrifugue el tubo de PCR que contiene la saliva/solución salina a 8,000RPM durante 3 minutos.
7. Busque el sedimento de células blancas en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el sobrenadante pipeteando el supernantant lejos del pellet y deséchelo en un contenedor de desechos biológicos. ¡Ten cuidado de no perturbar el pellet celular!
8. Agregar 50 µl de la solución de extracción al tubo de PCR con el sedimento celular. Resuspender las células mezclando usando la micropipeta y continúe haciéndolo hasta que el sedimento celular se rompa y ya no haya grandes grupos de células.
9. Necesitas incubar tu tubo a 95°C durante 5 minutos para romper las células y liberar el ADN en solución, seguido de enfriarlo hasta que esté listo para usar. Se puede colocar un tubo sobre hielo para enfriarlo. Si usa el sistema MiniOne, coloque el tubo en la máquina de PCR. Usando el dispositivo móvil con la aplicación móvil MiniOne PCR, programe la máquina de PCR usando el modo de temperatura constante para incubar las muestras a 95°C durante 5 minutos. Introducir 4°C para la temperatura de incubación final. Esto mantendrá tus muestras frías hasta que puedas recogerlas. (Cuadro 4)
   

   Tabla 4 Programa de Lisis Celular

   Paso	Duración	Temperatura
   Lisificación celular	5 min	95⁰C
   Incubación Final	∞	4⁰C

10. Recupere los tubos de PCR y centrifugue por 1 minuto a 8,000 RPM para recolectar restos celulares en el fondo del tubo. Ahora tu ADN se encontrará en el sobrenadante del tubo.
11. Sin perturbar el sedimento en la parte inferior, pipetee cuidadosamente 5µL del sobrenadante que contiene ADN en su ^2º tubo de PCR marcado.
12. A su tubo de PCR que contiene ADN, agregue 10 µL de Taq Master Mix y 5µL de mezcla de cebadores. Asegúrese de evitar colocar una burbuja en la parte inferior del tubo de PCR ya que esto puede afectar la reacción de PCR.
13. Tapar el tubo firmemente, mover suavemente el tubo para mezclar, luego centrifugar durante 15 segundos a 8,000RPM para llevar todo el líquido a la parte inferior del tubo.
14. Colocar el tubo de PCR en el termociclador. Cuando se carguen todas las muestras, cierre la tapa y siga las instrucciones del instructor para configurar el protocolo de PCR como se ve en la Tabla 16.5.
15. Una vez que se complete el protocolo, retire su muestra del termociclador y colóquela a -20⁰C hasta el siguiente periodo de clase.

Cuadro 5. Programa PCR

Paso	Duración	Temperatura	Ciclos
Desdesnaturalización inicial	30 seg	94⁰C
desnaturalización	5 seg	94⁰C	30 Ciclos
Recocido	10 seg	62⁰C
Extensión	15 seg	72⁰C
Incubación Final	∞	4⁰C

Parte II: Día 2

Figura 4. Reactivos Día 2

MATERIALES

Reactivos

• Muestra congelada almacenada del periodo anterior
• Nuevo tubo de PCR
• Enzima de restricción HaeIII
• Buffer de dilución
• Gel de agarosa con Gel Verde
• Tinte de carga
• Buffer de ejecución (TBE)
• Marcador de ADN

Equipo

• Baño de agua o termociclador programado
• Bandeja de fundición de gel y peine
• Unidad de electroforesis en gel
• Microcentrífuga
• Caja de luz azul
• Equipo de documentación fotográfica

Procedimiento

1. Obtenga su tubo de PCR de la sesión de laboratorio anterior
2. Divida su reacción en dos pipeteando 10 µL de su producto de PCR en un tubo de PCR limpio. Marque una “U” para no digerir y la otra “D” para digerida.
3. Agregue 5 µL de enzima de restricción HaelIII al tubo “D” y 5 µL de tampón de dilución enzimática al tubo “U”. Tapar los tubos y mover suavemente con los dedos para mezclar. Centrifugue sus tubos por 15 segundos a 8,000 RPM para recoger todo el líquido hasta el fondo del tubo.
4. Coloque sus tubos en un baño de agua o termociclador adecuado utilizando los ajustes de la Tabla 5. Al usar el Sistema MiniOne PCR, configurar la incubación para la digestión de restricción a 37⁰C por 15 minutos usando el modo de temperatura constante. Ingresa 4⁰C para la incubación final. (Ver cuadro 6)
   

   Cuadro 6. Programa HaeIII Digest

   Paso	Duración	Temperatura
   Incubación HaeIII	15 min	37⁰C
   Incubación Final	∞	4⁰C

5. Mientras esperas tu digestión, prepara un gel de agarosa. Necesitarás un tinte como gel verde incluido para visualizar el ADN en el gel. Lab 11 tiene instrucciones más detalladas si no estás usando el kit. Para el kit MiniOne, el gel verde se incluye en una cantidad premedida de agarosa. Haga un pequeño agujero en el plástico en la parte superior de la taza de gel para permitir que el vapor escape. Geles en microondas por incrementos de 20 segundos hasta que el gel esté completamente disuelto y en estado líquido. Vierte tu gel en la bandeja de colada usando el lado de 9 pocillos del peine. Permita que su gel se solidifique (será algo opaco cuando esté seco).
6. Cuando se complete la incubación, recupere sus muestras. Agrega 3 µL de colorante de carga a cada uno de tus tubos que contengan ADN. Tapar el tubo y sacudir suavemente para mezclar los reactivos. Centrifugue sus tubos por 15 segundos a 8,000RPM para llevar el líquido al fondo del tubo.
7. Obtenga su unidad de electroforesis. Para el Tanque de Gel MiniOne, asegúrese de que la plataforma negra esté en el tanque para ayudar en la visualización. Coloca tu gel en el tanque y asegúrate de que los pozos estén en el extremo negativo de la caja de gel.
8. Vierta el tampón de funcionamiento TBE en el tanque y asegúrese de que el gel esté completamente sumergido por el tampón. La inmersión incompleta del gel conducirá a verter resultados en la electroforesis en gel.
9. Enciende la luz azul de baja intensidad y carga 10 μL de tu muestra no digerida y 10 μL de tu muestra no digerida en dos pocillos adyacentes del gel. Asegúrate de que tu grupo también cargue un marcador de ADN en uno de los pozos. Su grupo puede usar 10 μL del marcador de ADN MiniOne®. Utilice la tabla 6 a continuación para realizar un seguimiento de qué muestras se cargan en qué pozos.
   

   Cuadro 7. Muestras cargadas

   Bueno	1	2	3	4	5	6	7	8	9
   Muestra

10. Encienda el Sistema de Electroforesis MiniOne colocando la cubierta naranja en la máquina y presionando el botón de encendido. La luz verde debe encenderse y pequeñas burbujas deben ser visibles en la solución tampón. Ejecutar las muestras durante 20 minutos para permitir la separación adecuada de las bandas. Si se usa un sistema de electroforesis diferente, ejecute el gel a 135V hasta que las bandas se separen suficientemente y el frente del tinte haya viajado aproximadamente 70% por el gel.
11. Al final de la carrera, enciende la luz azul de alta intensidad y usa tu teléfono, cámara o sistema de documentación de gel para tomar una foto del gel. La luz azul hace que el gel sea verde que se incorpora a las moléculas de ADN fluoresce para que puedan visualizarse.
12. Analizar el gel en base a la información proporcionada en la introducción de este laboratorio.
13. Deseche su gel y tampón TBE de acuerdo con las instrucciones del instructor.

Preguntas de Estudio

1. Si alguien puede probar PTC, ¿cuál es/son su posible genotipo (s)?
2. Si alguien es homocigótico por un rasgo versus heterocigótico, al comparar sus resultados en electroforesis en gel, qué diferencias, si las hay, esperas ver.
3. Cuando usaste PCR para amplificar el gen TAS2R38, ¿qué componente de la reacción lo hace específico para ese gen en tu genoma y no para otro gen?
4. Las enzimas de restricción reconocen secuencias muy específicas en el ADN. Leen lo mismo hacia adelante y hacia atrás. ¿Cómo se llaman estos tipos de secuencias?
5. Si no viste ninguna banda en tu reacción después de la electroforesis, ¿qué podría haber salido mal? Enumere dos posibles razones para este resultado.
6. Después de comparar tus bandas con las de las bandas de ADN marcador, ¿tus bandas y las de tus compañeros coincidieron con las bandas de tamaño esperado?
7. ¿Tus resultados en el análisis de bandas de ADN coinciden con tu fenotipo como catador o no catador basado en el sabor del papel? ¿Qué esperabas ver para los diferentes fenotipos de la clase?

Atribuciones

Este laboratorio tiene licencia como CC BY-NC-SA. El título, la figura 2 y el procedimiento son tomados del laboratorio desarrollado por Embi Tec y utilizados con permiso.