1.18: Diluciones en serie y curvas estándar con lectores de microplacas

Objetivos de aprendizaje

Objetivos:

• Realizar varias diluciones en serie.
• Utilice la espectrofotometría para medir la absorbancia de las soluciones.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Crear una serie de soluciones de concentraciones decrecientes mediante diluciones en serie.
• Mida la absorbancia de soluciones con un lector de microplacas.
• Generar curvas estándar en Excel.
• Evaluar la calidad de las curvas estándar por su valor R2.

Parte I: Diluciones en serie

Introducción

Una dilución en serie es una serie de diluciones realizadas secuencialmente, utilizando el mismo factor de dilución para cada etapa. El factor de concentración es el volumen inicial dividido por el volumen final de la solución; el factor de dilución sería el inverso del factor de concentración. Por ejemplo, si tomas 1 parte de una muestra y agregas 9 partes de agua (solvente), entonces has hecho una dilución 1:10; esto es 1/10th (0.1) de la concentración de la solución original y tiene un factor de dilución de 10. Estas diluciones en serie se utilizan a menudo para determinar la concentración aproximada de una enzima (o molécula) a cuantificar en un ensayo. Las diluciones en serie permiten diluir pequeñas alícuotas en lugar de desperdiciar grandes cantidades de materiales, son rentables y son fáciles de preparar.

Ecuación 1

\[\text{concentration factor}= \dfrac{\text{volume}_{\text{initial}}}{\text{volume}_{\text{final}}}\nonumber\]

\[\text{dilution factor}= \dfrac{1}{\text{concentration factor}}\nonumber\]

Figura 1. Una dilución en serie de diez veces, que también se puede llamar dilución 1:10, o una serie con factor de dilución de 10. Para determinar la concentración en cada paso de la serie, se divide la concentración previa por el factor de dilución. *Los tubos de dilución comienzan con 9 mL. Se agrega 1 mL y se mezcla, luego se transfiere 1 mL al siguiente tubo. El volumen final en el último tubo sería de 10 mL.

Diagrama de diluciones en serie 1:2

En su cuaderno, dibuje un diagrama que muestre las diluciones en serie para las soluciones de 6 kmNo ₄ que está preparando. En el diagrama, indique el volumen que se está retirando de la solución concentrada, el volumen de agua añadida, la concentración de la nueva solución y el volumen total.

Cálculos de práctica

Problema 1. Supongamos que la muestra original utilizada en la Figura 1 contenía 400 g/L de Reactivo X.

1. Entonces el primer tubo de dilución 1:10 tendría una concentración de 400/10 = __________
2. Entonces la segunda dilución 1:10 tendría una concentración de ____________

Problema 2. Supongamos que la muestra original utilizada en la Figura se considera concentración del 100%.

1. Entonces el primer tubo de dilución 1:10 tendría una concentración de _____%.
2. El segundo tubo de dilución 1:10 tendría una concentración de _____%.

Problema 3. Para hacer una dilución en serie con un factor de dilución de 5, se necesitaría agregar 1 parte del reactivo más ___ partes de agua para hacer un total de 5 partes. Esta dilución seriada de cinco veces tendría concentraciones del 100%, ______% en el primer tubo diluido, _____% en el segundo tubo diluido, ________% en el tercer tubo diluido.

Problema 4. Supongamos que el tercer tubo diluido de una dilución serial doble tiene una concentración de 300 g/L.

1. Eso significa que el segundo tubo diluido tiene una concentración de _________
2. El primer tubo diluido tiene una concentración de ________
3. El tubo original tiene una concentración de _______
4. ¿Qué fórmula podrías usar para calcular la concentración del tubo original a partir de la declaración del problema?

Parte 1: Hacer diluciones en serie

Materiales

Reactivos

• Tinte azul para alimentos
• DI H ₂ O
• Microplaca de 96 pozos (seca)

Suministros

• Micropipeta P200
• Caja de puntas de pipeta P200

Nota

Use una punta de pipeta por cada dilución en serie.

Procedimiento

Preparación de dilución en serie doble (factor de dilución de dos)

1. Obtener una microplaca limpia y seca de 96 pocillos, siempre tocando solo los bordes. Use una toalla de papel limpia en seco para limpiar las huellas dactilares en la parte inferior del plato.
2. Sostenga la placa hasta la luz y verifique que no haya manchas sucias en las tres filas que va a utilizar.
3. (Opcional) Puede escanear la placa sin líquido, para averiguar la absorbancia basal del plástico.
4. Pipetear 100 µL de DI-agua en los primeros 5 pozos de la fila A (A1-A5).
5. Pipetear 100 µL del tinte azul original en el primer pocillo (A1). Pipetear con cuidado hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar.
6. No es necesario cambiar la punta de la pipeta. Pero asegúrate de liberar todo el líquido en el primer pozo.
7. Transferir 100 µL de la mezcla al siguiente pocillo (A2). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
8. Transferir 100 µL de la mezcla al siguiente pocillo (A3). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
9. Transferir 100 µL de la mezcla al siguiente pocillo (A4). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
10. Transferir 100 µL de la mezcla al siguiente pocillo (A5). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
11. Transferir 100 µL de la mezcla al siguiente pocillo (A6). Toma una foto de los pozos encima de un papel blanco.

Preparación de dilución en serie cuádruple (factor de dilución de cuatro)

1. Usando una nueva punta de pipeta, pipetee 150 µL de di-agua en los primeros 5 pozos de la fila B (B1-B5).
2. No es necesario cambiar la punta de la pipeta. Pipetear 50 µL del tinte azul original en el primer pocillo (B1). Pipetear con cuidado hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar. Entonces asegúrate de liberar todo el líquido en el primer pozo.
3. Transferir 50 µL de la mezcla al siguiente pocillo (B2). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
4. Transferir 50 µL de la mezcla al siguiente pocillo (B3). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
5. Transferir 50 µL de la mezcla al siguiente pocillo (B4). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
6. Transferir 50 µL de la mezcla al siguiente pocillo (B5). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
7. Transferir 50 µL de la mezcla al siguiente pocillo (B6). Esto asegura que todos los pozos B1-B5 tengan el mismo volumen.
8. Toma una foto de los pozos encima de un papel blanco.

Preparación de dilución seriada de cinco veces (factor de dilución de cinco)

1. Usando una nueva punta de pipeta, pipetee 160 µL de di-agua en los primeros 5 pozos de la fila C (C1-C5).
2. No es necesario cambiar la punta de la pipeta. Pipetear 40 µL del colorante azul original en el primer pocillo (C1). Pipetear con cuidado hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar. Entonces asegúrate de liberar todo el líquido en el primer pozo.
3. Transferir 40 µL de la mezcla al siguiente pozo (C2). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
4. Transferir 40 µL de la mezcla al siguiente pozo (C3). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
5. Transferir 40 µL de la mezcla al siguiente pozo (C4). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
6. Transferir 40 µL de la mezcla al siguiente pozo (C5). Mezcle cuidadosamente y libere todo el líquido.
7. Transferir 40 µL de la mezcla al siguiente pozo (C6). Esto asegura que todos los pozos C1-C5 tengan el mismo volumen.
8. Toma una foto de los pozos encima de un papel blanco.

Figura 2: Microplaca y diluciones en serie.

Parte II: Medición de la absorbancia

Un lector de microplacas es un instrumento espectrofotométrico que puede medir la absorbancia de 96 muestras diferentes a la vez. ¿Eso ahorra tiempo en comparación con trabajar con cubetas individuales y un espectrofotómetro? Utilizaremos una microplaca con 96 pocillos, para que pueda realizar todas sus diluciones en serie en una placa y escanear toda la placa con el lector de microplacas una vez. La microplaca tiene filas marcadas A-H y columnas marcadas #1 -12. Usando tinte azul, hará una dilución en serie 1:2 en la fila A, hará una dilución en serie 1:4 en la fila B y una dilución en serie 1:5 en la fila C.

Materiales:

• Equipo
• Lector de microplacas y cables
• Computadora portátil con programa instalado para ejecutar el lector de microplacas

Procedimiento:

1. Acople el cable de la computadora portátil al lector de microplacas.
2. Encienda la computadora portátil y el lector de microplacas.
3. Abra el programa de computadora para ejecutar el lector de microplacas.
4. Presione el botón para abrir el lector de microplacas y exponer la plataforma de carga de microplacas.
5. Coloque su microplaca de forma segura en el área del soporte, asegurándose de que el pozo A1 esté en la esquina superior izquierda.
6. Presione el botón para cerrar el lector de microplacas.
7. En el programa de computadora, inicie “leer nueva placa” usando longitud de onda 595 nm (para tinte azul).
8. Con el ratón de computadora, resalte las celdas correspondientes a los pocillos de microplaca que utilizaste. Tome una foto de la pantalla de la computadora y anote los datos de Absorbancia en las tablas a continuación.
9. Calcular la concentración de colorante para cada pocillo, dividiendo el factor de dilución para cada paso de la dilución en serie. El tinte original tiene una concentración del 100%.

Datos Cuadro 1. Mediciones de absorbancia de dilución en serie doble con lector de microplacas

Bueno	A1	A2	A3	A4	A5
Absorbancia @ 595 nm
Concentración de tinte

Datos Cuadro 2. Mediciones de absorbancia de dilución en serie cuádruple con lector de microplacas

Bueno	A1	A2	A3	A4	A5
Absorbancia @ 595 nm
Concentración de tinte

Datos Cuadro 3. Mediciones de absorbancia de dilución seriada de cinco veces con lector de microplacas

Bueno	A1	A2	A3	A4	A5
Absorbancia @ 595 nm
Concentración de tinte

Parte III: Curvas estándar

Introducción

Las curvas estándar (también conocidas como curvas de calibración) muestran la relación entre dos cantidades. Las curvas estándar se utilizan con mayor frecuencia para determinar la concentración de muestras “desconocidas” comparándolas con muestras de referencia con concentraciones “conocidas”. Posteriormente en el curso, utilizaremos curvas estándar para medir cantidades de proteína extraída y determinar el tamaño de las moléculas de ADN. En el laboratorio de hoy, usted realizó tres diluciones en serie y debería poder calcular las concentraciones para cada dilución. Usando Excel, preparará curvas estándar para cada dilución en serie y determinará si su curva estándar es precisa. Después determinarás la concentración de muestras desconocidas, usando tus curvas estándar.

Figura 3: Curva estándar de una dilución seriada de cinco veces

El valor R-cuadrado (R2) es el coeficiente de correlación o el cuadrado de la correlación. Para la curva estándar, este valor mide qué tan fuerte es la relación lineal entre la concentración de reactivo (eje X) y el valor de absorbancia (eje Y). Si el valor R2 = 1, entonces eso muestra una relación positiva perfecta. Dado que sus curvas estándar se generan a partir de las diluciones en serie que pipeteó, los valores R2 también pueden mostrar cuán precisas son sus habilidades de pipeteado.

Actividad A: Realización de una Curva Estándar para Cada Dilución en Serie

1. Ingresa los datos en Excel.
2. Selecciona los valores de datos con el ratón. En la pestaña Insertar, haga clic en el icono Dispersión y seleccione Dispersión con líneas rectas y marcadores en su menú desplegable para generar la curva estándar.
3. Asegúrese de agregar el título de la gráfica y etiquetas para los ejes X e Y.
4. Para agregar una línea de tendencia a la gráfica, haga clic con el botón derecho en la línea curva estándar del gráfico para mostrar un menú emergente de acciones relacionadas con el trazado. Elija Agregar línea de tendencia en este menú.
5. Seleccione “mostrar ecuación en gráfico” y “mostrar valor R cuadrado en gráfico”. Idealmente, el valor R2 debería ser mayor a 0.99.
6. Imprima las curvas estándar y agréguela a su cuaderno.

Actividad B: Determinación de la Concentración de Muestras “Desconocidas”

1. Su instructor tendrá varias muestras desconocidas.
2. Determinar los valores de absorbancia de cada muestra.
3. En su curva estándar, use la ecuación gráfica para resolver la concentración correspondiente de estas muestras. O estimar a partir de la gráfica de líneas.

Datos Cuadro 4. Concentración comparada con las gráficas de dilución

Muestra desconocida	Absorbancia	2 veces	4 veces	5 veces

Preguntas de Estudio

1. Usando una dilución en serie, describa cómo prepararía 10 mL de soluciones de NaOH 1.0%, 0.1% y 0.01%. La solución madre es NaOH al 10%. Dibuja diagramas como parte de tus descripciones/protocolos.
2. Usando la curva estándar representada, calcular la concentración de una solución desconocida si su valor de absorbancia es 0.55.
3. Evaluar la calidad de la curva estándar (ver diagrama) usando el valor R2.

Figura 4. Curva estándar de absorbancia de Cobre II