1.19: Verter placas de agar

Objetivos de aprendizaje

Objetivos:

• Aprende los fundamentos de la técnica aséptica.
• Aprende a preparar placas de agar estériles para el cultivo de bacterias

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Practica la técnica aséptica.
• Esterilizar y verter placas de agar a mano

Introducción

Los microbios están a nuestro alrededor. En el laboratorio 4, nuestra clase tomó muestras de varias superficies y descubrió que los microbios se encontraban fácilmente en todas partes del ambiente. Se utilizaron placas de agar estériles que proporcionaron los nutrientes y el pH correcto para que las bacterias crecieran. En este laboratorio, estarás aprendiendo a producir estas placas de agar estériles.

El agar es un polisacárido derivado de algas rojas. El polvo de agar se disuelve primero en un líquido hirviendo y luego se enfría para formar una matriz sólida gelatinosa. Como los microbios no pueden digerir el agar, este material se usa comúnmente en laboratorios para contener los nutrientes que las bacterias necesitan.

Aquí se presentan las principales instrucciones para verter placas de agar. Pero hay muchas recetas diferentes para preparar medios de crecimiento para bacterias, ya que algunas especies bacterianas requieren diferentes combinaciones de nutrientes. Algunos tipos de agar comunes incluyen agar sangre, agar Luria Bertani (LB), agar MacConkey, agar nutriente (NA) y agar tríptico de soja (TSA). Siga las instrucciones específicas del paquete con respecto a las cantidades de polvo y agua para usar para los medios de crecimiento que está haciendo. La receta para hacer agar LB de 1 litro es 9.1 g de triptona 4.6 g de extracto de levadura, 4.6 g de NaCl y 13.7 g de agar. Si se necesita un aditivo antibiótico en la receta del medio, eso se agrega después de que el agar esterilizado se haya enfriado a 60oC para evitar la desnaturalización.

Un autoclave es un aparato de alta presión que es utilizado por laboratorios, dentistas y hospitales para esterilizar equipos, instrumentos, cristalería, medios de crecimiento, líquidos y desechos biopeligrosos. El autoclave aplica alta presión (15 psi) y vapor saturado a 121oC (250oF) durante 15-20 minutos para matar microbios y esporas. Después de que los medios hayan pasado por este ciclo, es estéril. Enfriar a 60-65oC antes de agregar cualquier antibiótico y verterlo en placas Petri estériles.

Figura 1. Balanzas Digitales y Balanzas

Materiales

• spray desinfectante
• toallas de papel
• placas de Petri
• guantes
• Polvo de agar LB
• Embarcación de pesaje
• Barra de revolver
• Frasco autoclavable de 500 mL
• Cinta Autoclave
• Marcador Sharpie (de color)
• Agua desionizada o destilada
• Balanza electrónica
• Autoclave o olla a presión
• Bandeja metálica
• Ampicilina o arabinosa

Figura 2. Algunos insumos para la preparación de placas con medios

Procedimiento

Preparando los medios

1. Etiquete una botella esterilizable en autoclave de vidrio limpio de 500 mL con el nombre del medio, la fecha y la inicial.
   • Nota: solo llene la botella hasta la mitad, para evitar el desbordamiento durante el proceso de calentamiento en el autoclave.
2. Para una botella de 500 mL, calcule el peso necesario de medio en polvo para hacer 250 mL. Restar eso de 250 para determinar el volumen de agua a agregar.
3. Agrega __ mL de agua destilada a la botella.
4. Agrega __ g de medio con agar en polvo a la misma botella. (su total debe ser de 250 mL)
5. Agrega una barra de revolver (opcional). Revuelva o agite hasta que esté completamente mezclado y verifique que no haya grumos.
6. Agregue un trozo de cinta de autoclave a la tapa o botella y afloje la tapa media vuelta. Si usa un recipiente sin tapa, luego cubra sin apretar con papel de aluminio

Configuración del autoclave

1. Coloque las botellas de medios preparadas en una bandeja metálica.
2. Agrega agua destilada hasta que cubra el fondo de la bandeja; aproximadamente 1-2 cm de profundidad.
3. Colocar en el autoclave.
4. Autoclave a 121 ^o C por 15 minutos a 15 psi.
5. Una vez que se complete el ciclo, use guantes resistentes al calor para retirar la bandeja y las botellas de la máquina.
6. Permita que las botellas se enfríen a aproximadamente 60 ^o C.

Preparación del espacio de trabajo:

1. Para mantener un ambiente lo más estéril posible para evitar contaminar los medios y las placas, ponte una bata de laboratorio y guantes, y usa un agente desinfectante o toallitas para limpiar todas las superficies.
2. Esto incluye mesas y bordes, guantes, tijeras, marcadores permanentes, etc.
3. Asegúrate de limpiarte los guantes si han tocado otra superficie que no esté desinfectada (por ejemplo, si tocaste la cara, el brazo, la silla, etc.).
4. Si están disponibles, use quemadores Bunsen y vierta cuidadosamente cerca de la llama abierta para prevenir mejor los contaminantes en el aire.
5. Una vez que el área esté desinfectada, saque las placas Petri estériles. Mantenga los platillos estériles cerrados.
6. Levanta una bolsa verticalmente.
7. Para conservar la bolsa de placa para reutilizarla para su almacenamiento, ignore cualquier marca de “Tear Here” y corte una pequeña esquina de la parte superior de la bolsa. Inserta la mitad de las tijeras en esta abertura y corta a lo largo del pliegue de la bolsa.
8. Voltear toda la pila de placas boca abajo, con la abertura cortada en la parte inferior de la pila.
9. Aplique suavemente una pequeña cantidad de presión hacia abajo mientras enrolla simultáneamente la bolsa hacia arriba.
10. Dobla o enrolla la bolsa vacía y déjala a un lado para usarla para volver a embolsar.

Rayado de las placas

1. Para diferenciar rápidamente entre placas que tienen una apariencia similar, se puede utilizar un código de banda. Una combinación de marcadores permanentes de diferentes colores puede significar diferentes aditivos para una placa. Por ejemplo, una franja verde puede significar que se agregó ampicilina, un tipo de antibiótico, a los medios en esa placa. Los códigos de rayado son específicos de un laboratorio individual, así que siempre verifique la clave del código.
2. Para rayar un plato, la parte superior E inferior deben estar etiquetadas con el código.
3. Toma el marcador con el color de la llave, y con la pila de platos sin bolsa, aplica una suave cantidad de presión con la mano sobre la parte superior de la pila.
4. Dibuja una línea recta hacia abajo desde el borde superior hasta la base de cada placa de la pila.
5. Si se hace rápidamente, es posible que deba volver a entrar y volver a dibujar la línea en la base inferior.
6. Si el código de franja tiene otra línea o color, repita el proceso agregando otra línea.
7. El espaciado de la segunda línea debe estar dentro de 1 cm de la primera línea.
8. Repita el proceso hasta que el código de banda esté completo.

Ajuste de las placas

1. Comenzar a desapilar las placas. Asegúrese de que las partes superiores e inferiores de las placas no se separen.
2. Coloque las placas individuales alrededor del borde de la mesa (no en pilas), para crear una línea o cadena de placas.

Figura 3: Platos de vertido

Verter los Platos

1. Una vez que el medio se ha enfriado a 60 o C, la solución líquida está lista para ser vertida.
2. En este momento, se puede agregar un antibiótico (por ejemplo: ampicilina) al medio y se agita suavemente o se agita para mezclarlo. Nota: no agregue el antibiótico si el líquido está más caliente a 60 o C, ya que el antibiótico estaría desnaturalizado.
3. Destapa la botella de medios y sostén la botella en tu mano dominante. Nota: una vez abierta la botella, no hables. Hablar permitirá que las bacterias de su boca lleguen a ser transportadas por el aire y pueden contaminar los medios.

4. La tapa se puede sostener en la misma mano (entre los dedos) que tu botella o se puede colocar sobre una superficie desinfectada.
5. Agarra un plato con la otra mano y deslízalo hacia el borde de la mesa, mientras lo mantienes cerrado.
6. Una vez que la placa esté en el borde, abra la tapa como si hubiera una bisagra imaginaria en un extremo; así la placa se abre como una concha.
7. Vierte el medio en el fondo del plato hasta que solo cubra la superficie. No sobrellene.
8. Cierre la tapa y deje que se enfríe. Los medios de comunicación serán sólidos.
9. Deje las placas fuera por un día si es posible para que la condensación se evapore de la placa. Se pueden colocar las placas en una incubadora a 25C durante la noche.
10. Apila las placas con el mismo tipo de soporte y desliza la funda de plástico sobre la parte superior.
11. Da la vuelta a la pila y sella la funda de plástico con cinta adhesiva.
12. Etiquete la cinta con el tipo de medio, fecha de producción y nombre del individuo que produjo la pila.
13. Guarde las pilas selladas en el refrigerador hasta su uso.

PREGUNTAS DE ESTUDIO

1. ¿Cuál es la cantidad típica de agar incluida en 1 L de medio?
2. ¿Por qué hay que tomar tales precauciones para desinfectar el espacio y evitar acciones que puedan hacer que las bacterias y el moho lleguen al aire? ¿Cuál es el término que se aplica a estas precauciones y procedimientos?
3. ¿El agar aporta nutrientes a las bacterias?
4. ¿Por qué no se puede incluir ampicilina en los medios antes de ser autoclavada?
5. ¿Por qué debes dejar fuera las placas solidificadas por un día antes de sellarlas y refrigerarlas?