1.11: Tecnología de ADN recombinante

Objetivos de aprendizaje

• Comprender la importancia de la tecnología de ADN recombinante.
• Aprender el aislamiento del ADN y su separación en un gel de agarosa.
• Entender las enzimas de restricción y ligasa y su aplicación en la clonación génica.
• Comprender los vectores y su aplicación en la clonación y expresión de genes.
• Entender la reacción de terminación en cadena de polimerasa (PCR).

Introducción

La tecnología de ADN recombinante (ADNr) ha dado como resultado avances en la biotecnología de cultivos y animales. El poder de la tecnología de ADNr proviene de nuestra capacidad para estudiar y modificar la función génica manipulando genes y transformándolos en células de plantas y animales. Para llegar a esto se utilizan diversas herramientas de biología molecular que incluyen, aislamiento y análisis de ADN, clonación molecular, cuantificación de la expresión génica, determinación del número de copias génicas, transformación del hospedador apropiado para replicación o transferencia a plantas de cultivo y análisis de plantas transgénicas.

Definición y antecedentes

La tecnología de ADNr recombinante implica procedimientos para analizar o combinar fragmentos de ADN de uno o varios organismos (Figura 1) incluyendo la introducción de la molécula de ADNr en una célula para su replicación, o la integración en el genoma de la célula diana.

Figura 1. El ADN recombinante se elabora a partir de la combinación de ADN de diferentes fuentes. Imagen de Walter Suza.

Los avances en biología molecular a principios de la década de 1970, incluido el éxito en la creación y transferencia de moléculas de ADN a las células, revolucionaron tanto la ciencia como la industria. Los primeros organismos genéticamente modificados fueron bacterias que elaboraban proteínas simples de interés farmacéutico, por ejemplo, la insulina. A medida que mejoraban las tecnologías, otros organismos, incluidas las plantas, se volvieron susceptibles de mejora mediante la tecnología de ADNr. En el Cuadro 1 se presentan hitos importantes en el desarrollo y aplicación de la tecnología de ADNr.

Cuadro 1.Eventos relacionados con el desarrollo y aplicación de la tecnología de ADN recombinante.

Evento

Año

Los experimentos de Mendel publicados

1866

ADN descubierto en la célula

1869

Mutación de genes por rayos X

1927

Hipótesis de una enzima gene-uno

1941

El ADN se identifica como el material genético

1944

Estructura del ADN determinada

1953

Los ribosomas sintetizan proteína

1954

Función de ARNm propuesta

1961

Código genético determinado

1961-64

Aislamiento de una enzima de restricción

1970

Técnicas de ADN recombinante desarrolladas

Principios de la década de 1970

Aislamiento de un gen de copia única de eucariota superior

1977

Se desarrolló un método rápido de secuenciación de ADN

1977

Transformación de plantas

1983

Pruebas de campo de plantas transformadas

ca. 1986

Lanzamiento de plantas de ingeniería al público en general en Estados Unidos

1995-96

La transformación de células con ADNr produce organismos llamados organismos biomodificados o genéticamente modificados (OGM). Los OGM contienen nuevos rasgos de otro organismo. Los primeros OGM fueron células de Escherichia coli que se transformaron con genes de humanos para producir diversas proteínas con fines farmacéuticos.

Aislamiento de ADN, digestiones de restricción y su separación en un gel de agarosa:

Preparación de ADN

Para que los procedimientos de ADN recombinante funcionen, se debe obtener una muestra de ADN puro. El desafío es que las células vegetales y animales producen muchos otros compuestos que a menudo actúan como contaminantes y pueden inhibir la clonación o secuenciación del ADN. Además, los tejidos y órganos de la misma planta, o diferentes plantas, a menudo contienen diferentes composiciones de metabolitos, por ejemplo, proteínas, lípidos e hidratos de carbono. Estos compuestos deben separarse del ADN durante el aislamiento. Para lograrlo, los científicos aprovechan las propiedades químicas y físicas de diferentes moléculas dentro de la célula. Por ejemplo, el ADN está cargado negativamente, haciéndolo soluble en solución acuosa. Sin embargo, los grupos fosfato de azúcar polares del ADN son repelidos por soluciones no polares. Por lo tanto, el paso final en muchos protocolos de purificación de ADN implica la precipitación usando alcohol. Otros compuestos, por ejemplo, las proteínas también se pueden separar fácilmente del ADN alterando la concentración de sal en el tampón de extracción.

Digestión de ADN con endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción son un grupo de enzimas derivadas (principalmente) de bacterias. Aunque existen varios tipos diferentes de enzimas de restricción, las más útiles para la tecnología de ADNr reconocen secuencias cortas específicas en el ADN y escinden el ADN en ese sitio para producir fragmentos cohesivos (pegajosos) o de extremos romos (Figura 2).

Figura 2. Ejemplo de cómo las enzimas de restricción cortan el ADN. (A) El tratamiento del ADN con SmaI da como resultado fragmentos con extremos romos. (B) Mientras que el tratamiento con BamHI produce fragmentos con extremos “cohesivos” o “pegajosos”. Imagen de Walter Suza.

Se han identificado más de 500 enzimas de restricción diferentes y se pueden adquirir comercialmente. Así, uno puede preguntarse, ¿con qué frecuencia corta una enzima de restricción dentro de una secuencia genómica? No es posible dar una respuesta exacta a esta pregunta. Sin embargo, supongamos que hay 4 bases en cualquier hebra de ADN. Esto significa que la probabilidad de detectar una A (adenina) en una ubicación particular es 1/4. Ahora, dado que la mayoría de las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de 6 bases de largo, la probabilidad de encontrar dicho sitio es (1/4) 6 = 1 sitio por cada 4,096 pares de bases (pb). Suponiendo que haya aislado ADN genómico del maíz, y quiera digerirlo con una enzima de restricción que corte cada 4,096 (4,100) pb, ¿cuántos fragmentos obtendrá? Para responder a esta pregunta, es necesario tener una idea del tamaño del genoma de la planta con la que está trabajando. El tamaño aproximado del genoma del maíz es de 2,500,000,000 pb. Así, usando una enzima que corta cada 4,100 nucleótidos se esperaría obtener 2,500,000,000 bp/4,100 pb, aproximadamente 610, 000 fragmentos. Tenga en cuenta que la distribución de nucleótidos no siempre es aleatoria y por lo tanto la frecuencia puede ser diferente para el ADN dado. Además, la metilación de bases específicas en el ADN genómico puede prevenir la escisión en algún sitio.

Separación de ADN genómico digerido en gel de agarosa

Las únicas características físicas de los fragmentos de ácido nucleico que se utilizan rutinariamente para su caracterización son su tamaño y secuencia de nucleótidos. El peso molecular del ADN se evalúa más convenientemente por electroforesis en geles de agarosa. La agarosa forma un gel por enlaces de hidrógeno cuando se enfría desde el estado fundido. Este gel, red entretejida de cadenas de agarosa, interfiere con el movimiento del ADN a través del gel (ver Lección sobre PCR y Electroforesis en Gel). El tamaño de poro, que afecta la velocidad de movimiento de los fragmentos de ADN de un tamaño dado, depende de la concentración de agarosa. El gel se sumerge en solución electrolítica; la muestra se carga en pocillos en un extremo y se aplica corriente para facilitar el movimiento de los fragmentos de ADN. Dado que el ADN está cargado negativamente migrará en el campo eléctrico. Los fragmentos se separan según el tamaño. La distancia de migración en cada tiempo es proporcional a 1/log MW. Después de la electroforesis en gel, el ADN se puede visualizar mediante tinción con bromuro de etidio (ver Lección sobre PCR y electroforesis en gel) u otras manchas de ADN.

Figura 3. La electroforesis en gel se usa para separar moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN) o proteínas por su tamaño. Para el ADN, la muestra se coloca en un campo eléctrico y el ADN cargado negativamente migrará al electrodo positivo. La velocidad de migración depende del tamaño del fragmento de ADN. El uso de matriz semisólida como agarosa o gel de poliacrilamida facilita la separación de las moléculas de ADN. Imagen de NIH-NHGRI.

Herramientas para la clonación de genes (ADN)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método mediante el cual se producen millones de copias de un fragmento de ADN en un tubo de ensayo en cuestión de minutos o pocas horas. Los pasos básicos en la reacción PCR se discutieron en la Lección sobre PCR y Electroforesis en Gel.

Una vez que se conoce la secuencia de un gen en particular, se hace posible usar PCR para aislar ese gen de cualquier muestra de ADN. Recuerda en la lección sobre transcripción génica aprendiste que a nivel genómico un gen está compuesto por secuencias reguladoras, codificantes y secuencias no codificantes. Así, si el objetivo es usar PCR para aislar secuencias tanto reguladoras como no reguladoras de un gen, el enfoque sería usar ADN como material de partida.

En la clonación de genes por PCR, se añaden sitios de enzimas de restricción en el extremo 5' de los cebadores para facilitar la clonación de fragmentos de PCR. Unos pocos nucleótidos adicionales (~6 nucleótidos) añadidos en el extremo 5' de los sitios de restricción para facilitar la digestión de restricción de los productos de PCR antes de la clonación en un vector plasmídico. Alternativamente, los productos de PCR pueden clonarse directamente en un vector T sin digestiones de restricción en E. coli (leer más sobre los sistemas de vectores de clonación Promega). Después de clonar en E. coli, el fragmento se analiza por secuenciación y luego se subclona en vectores adecuados para estudios de expresión.

Como todos los demás procesos bioquímicos, la síntesis de ADN por PCR no es un proceso perfecto, y ocasionalmente la enzima polimerasa agregará una base incorrecta a la cadena de ADN en crecimiento. En el contexto de la replicación del ADN en una célula, los errores son corregidos por la ADN polimerasa, esto se denomina “corrección de pruebas”. Las polimerasas disponibles comercialmente pueden o no tener capacidad de corrección.

Otra consideración importante en el análisis de PCR es la contaminación.

La contaminación menor del material de partida puede tener graves consecuencias. Recordemos que cantidades diminutas de ADN de partida pueden amplificarse a millones de copias a través de PCR. Si uno mezcla inadvertidamente (o descuidadamente) ADN de dos fuentes diferentes, los resultados serán confusos haciendo imposible distinguir líneas y puede costar tiempo y dinero a un laboratorio. Asegurar que se sigan los procedimientos adecuados en la preparación de los ensayos de PCR. Una fuente común de contaminación en biología vegetal son los productos de procesos de amplificación anteriores. Una reacción PCR completa contendrá millones de copias de fragmentos amplificados de manera que incluso una pequeña gota o aerosol de una punta de pipeta contendrá una enorme cantidad de moléculas amplificables. Siempre es esencial ejecutar controles negativos que revelen la presencia de ADN contaminante en sus ensayos de PCR.

Definición y requisitos del vector de clonación

Un vector de clonación es una secuencia de ADN especializada que puede entrar en una célula viva y proporcionar medios para la detección de su presencia a un investigador al conferir una propiedad seleccionable a la célula hospedadora (por ejemplo, resistencia a antibióticos), y poseer medios para la autorreplicación. Un vector también debe poseer rasgos físicos fácilmente distinguibles, como el tamaño o la forma, para permitir la purificación lejos del genoma de la célula huésped.

Enzima ligasa y clonación de genes

El corte y unión de vectores y fragmentos de ADN de diferentes orígenes da como resultado ADNr. Recordemos que las endonucleasas de restricción se utilizan para cortar el ADN. Para unir moléculas de ADN, se utiliza una enzima llamada ADN ligasa. La enzima ADN ligasa se utiliza para sellar juntos fragmentos de restricción formando nuevos enlaces fosfodiéster. El vector ligado y el fragmento de ADN pueden transformarse ahora en una célula hospedadora para replicación y expresión.

La transformación de E. coli toma varios pasos. Primero, se inserta un gen de interés en un plásmido que contiene un marcador seleccionable que generalmente codifica la resistencia a un antibiótico. En segundo lugar, el constructo plasmídico que contiene el gen de interés se transforma en células bacterianas exponiendo brevemente la mezcla de plásmido ligado-fragmento de ADN (molécula de ADNr) y células bacterianas a frío (0 ^o C) y calor (37-42 ^o C). El siguiente paso es hacer crecer las células transformadas en medios de selección que contienen un antibiótico. Solo sobrevivirán las células que hayan sido transformadas con el plásmido que contiene el gen de interés y el marcador de resistencia al antibiótico. Además de usar un antibiótico, los sistemas de vectores plasmídicos que contienen el gen lacZ que codifica β-galactosidasa permiten una selección más fácil de colonias positivas que pueden albergar la molécula de ADNr de interés.

Tipos de vectores de clonación

Un ejemplo de un vector de clonación es un plásmido (Figura 4), definido como un ADN circular extra cromosómico de replicación autónoma que se transmite fielmente a la progenie. Los plásmidos son ADN circular bicatenario y varían en tamaño de aproximadamente 1 kb a 200 kb. Los más útiles para la clonación son de 2 a 10 kb porque los plásmidos más pequeños son más fáciles de manipular y generalmente producen un mayor número de copias cuando se cultivan en células hospedadoras bacterianas.

Figura 4. Mapa básico de un vector plasmídico. El MCS contiene varios sitios de enzimas de restricción y pocos se muestran aquí como ejemplo. Imagen de Walter Suza.

Generalmente, no se clona más de 10 kb en plásmidos. Para clonar grandes fragmentos de ADN con alta eficiencia, se utiliza un vector llamado bacteriófago lambda. Los fragmentos de ADN cromosómico grandes cercanos a 23 kb son estables cuando se introducen en un vector de fago lambda.

ARNm como material de partida para la clonación génica

Recuerda en la Lección sobre Transcripción aprendiste sobre la síntesis de ARN a partir del ADN a través del proceso de transcripción. La transcripción es un paso importante en la expresión génica. El ARNm producido puede aislarse y “copiarse” de nuevo al ADN mediante un proceso llamado transcripción inversa (Figura 5). El primer paso de la transcripción inversa imita una estrategia utilizada por retrovirus (por ejemplo, VIH) que tienen genomas de ARN. Como parte de su paquete de transmisión génica, los retrovirus también contienen una enzima llamada ADN polimerasas dependientes de ARN, comúnmente conocida como transcriptasa inversa. Después de infectar una célula hospedadora, el retrovirus utiliza su transcriptasa inversa para copiar su genoma de ARN monocatenario en una cadena de ADN complementario (ADNc). La transcriptasa inversa luego sintetiza la segunda cadena de ADN de la primera cadena para hacer una copia de ADN bicatenario que se integra en el genoma del huésped.

Si solo se requiere la secuencia codificante de un gen, aislar el gen de los ADNc sería la estrategia. Es importante que los ADNc se sintetizen a partir de tejidos que expresan el gen de interés. Así, el conocimiento previo de dónde es funcional el gen es importante en la construcción de las moléculas de ADNc para clonar el gen de interés.

Los ADNc producidos in vitro (Figura 4) pueden ser utilizados para el análisis de PCR, similar al ADN cromosómico. La combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) es una herramienta valiosa en la clonación de genes y cuantificación de ARNm.

Figura 5. Una población de ARNm aislado de tejidos vegetales se combina con cebadores oligo (dT) que se hibridan con la cola poli (A) de los ARNm para iniciar la transcripción inversa de ADNc a partir del molde de ARNm con dNTPs. El resultado son moléculas híbridas (ARNm-ADN). El tratamiento con RNasa H provoca la degradación del ARNm dejando un ADN monocatenario intacto (primera cadena). La ADN polimerasa sintetiza la segunda cadena añadiendo dNTPs complementarios a la cadena en crecimiento. Los reactivos para RT suelen venir en kits premezclados haciendo que dicho ensayo sea fácil de llevar a cabo de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios. La mayoría de los ARNm de las células en los tejidos analizados se convierten en ADNc. Así, usando cebadores específicos para una secuencia, ese ADNc bicatenario puede amplificarse mediante PCR para diversos fines, por ejemplo, clonación génica. Imagen de Walter Suza.

Resumen de la lección

La tecnología de ADN recombinante ha contribuido significativamente al desarrollo de la biotecnología agrícola. La transformación de células con ADNr produce organismos llamados organismos biomodificados o genéticamente modificados. Las herramientas para la tecnología de ADNr vegetal incluyen, vectores, enzimas de restricción, enzimas de ligación, hospedadores bacterianos, métodos para aislar y multiplicar ácidos nucleicos, métodos para cuantificar ácidos nucleicos, Agrobacterium como vector para insertar ADN extraño en plantas.

Actividades de la lección

Actividad 1

A continuación se muestra un fragmento de ADN hipotético que contiene sitios de restricción para EcoRI y BamHI.

1. ¿Cuántos fragmentos se producirán después de cortar el ADN con BamHI? ¿Qué tamaño tendrán estos fragmentos en pb?
2. ¿Cuántos fragmentos se producirán después de cortar el ADN con BamHI y EcoRI al mismo tiempo? ¿Qué tamaño tendrán estos fragmentos en pb?
3. ¿Cuántos fragmentos se producirán después de cortar el ADN con EcoRI? ¿Qué tamaño tendrán estos fragmentos en pb?

Actividad 2

1. Es necesario clonar un fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de un vector plasmídico de expresión en E. coli. El fragmento tiene 1,809 pb de longitud. Hay un sitio BamHI en el fragmento a 1,204 pb. En el vector plasmídico, existe un único sitio BamHI en la región promotora para la expresión del gen en E. coli. El sitio BamHI está 100 pb aguas arriba del sitio de clonación EcoRI.

Después de clonar el fragmento EcoRI obtendrás dos clases de clones, solo uno de los cuales producirá la proteína. Describe el enfoque que tomarás para identificar la clase correcta de clones para la expresión del gen en E. coli.