3.5: Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es ahora uno de los ensayos más utilizados para obtener un segmento particular de ADN o ARN. Es rápido y extremadamente sensible. Al amplificar un segmento designado de ADN, proporciona un medio para aislar ese segmento o gen de ADN en particular. Este método requiere el conocimiento de la secuencia de nucleótidos en los extremos de la región que se desea amplificar. Una vez que se sabe eso, se pueden hacer grandes cantidades de esa región comenzando con cantidades minúsculas de material, como el ADN dentro de un solo cabello humano. Con la disponibilidad de secuencias casi completas o completas de genomas de muchas especies, el rango de genes a los que se puede aplicar es enorme. Las aplicaciones de la PCR son numerosas, desde diagnósticos hasta forenses, aislamiento de genes hasta estudios de su expresión.

El poder de la PCR radica en el aumento exponencial en la cantidad de ADN que resulta de ciclos repetidos de síntesis de ADN a partir de cebadores que flanquean una región determinada, un cebador diseñado para dirigir la síntesis complementaria a la cadena superior, el otro diseñado para dirigir la síntesis complementaria a la cadena inferior (Figura \(\PageIndex{1}\)). Cuando esto se hace repetidamente, hay aproximadamente un aumento de 2 veces en la cantidad de ADN sintetizado en cada ciclo. De esta manera es posible generar un aumento de millones de veces en la cantidad de ADN de la región amplificada con un número suficiente de ciclos. Este incremento exponencial en abundancia es similar a una reacción química en cadena, de ahí que se le llame la reacción en cadena de la polimerasa.

Figura\(\PageIndex{1}\): Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR). (CC BY-SA 3.0; Enzoklop)

Los eventos en la reacción en cadena de la polimerasa se examinan con más detalle en la Figura\(\PageIndex{2}\). Los diversos paneles muestran lo que sucede en cada ciclo. Cada ciclo consiste en una etapa de desnaturalización a una temperatura superior a la temperatura de fusión del ADN dúplex (por ejemplo, 95 ^o C), luego una etapa de reasociación a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión para el molde de cebador (por ejemplo, 55 ^o C), seguido de extensión del cebador por ADN polimerasa usando dNTPs proporcionados en la reacción. Esto se realiza a la temperatura óptima para la ADN polimerasa (por ejemplo 70 ^o C para una polimerasa termoestable). Los termocicladores están disponibles comercialmente para llevar a cabo muchos ciclos de forma rápida y confiable (Figura\(\PageIndex{3}\)).

Figura\(\PageIndex{2}\): Etapas en la reacción en cadena de la polimerasa.

La plantilla suministrada para la reacción es la única disponible en el primer ciclo, y sigue siendo una plantilla importante en el segundo ciclo. Al final del segundo ciclo, se elabora un producto cuyos extremos están definidos por cebadores. Este es el producto deseado, y sirve como la plantilla principal para los ciclos restantes. La plantilla inicial aún está presente y puede ser utilizada, pero no sufre la expansión exponencial observada para el producto deseado.

Si n es el número de ciclos, la cantidad de producto deseado es aproximadamente 2 ^n-1 —2 veces la cantidad de ADN de entrada (entre los cebadores). Así, en 21 ciclos, se puede lograr un aumento de millones de veces en la cantidad de ese ADN (asumiendo que todos los ciclos son completamente eficientes). Una muestra con 0.1 pg del segmento de ADN entre los cebadores puede amplificarse a 0.1 mg en 21 ciclos, en teoría. En la práctica, se realizan aproximadamente 25-35 ciclos en muchos ensayos de PCR.

Figura\(\PageIndex{2}\): Un termociclador para PCR. (CC BY-SA 3.0; Rror).

La facilidad de hacer PCR se incrementó en gran medida por el descubrimiento de ADN polimerasas que fueron estables a altas temperaturas. Estos han sido aislados de bacterias que crecen en aguas termales, como las que se encuentran en el Parque Nacional Yellowstone, como Thermus aquaticus. La polimerasa Taq de esta bacteria conservará la actividad incluso a las altas temperaturas necesarias para fundir los moldes, y es activa a una temperatura entre la temperatura de fusión y la de reasociación. Esta polimerasa en particular es bastante propensa a errores, y se han descubierto otras polimerasas termoestables que son más precisas.