3.6: ADNc

Los clones de ADNc son copias de ARNm

La construcción de clones de ADNc implica la síntesis de ADN complementario a partir de ARNm y luego insertar una copia dúplex del mismo en un vector de clonación, seguido de transformación de bacterias (Figura\(\PageIndex{1}\)).

Figura\(\PageIndex{1}\): Realización de clones de ADNc

a. Síntesis de la primera cadena: Primero, se hibrida un cebador oligo dT sobre la cola poliA 3' de una población de ARNm. Luego, la transcriptasa inversa iniciará la síntesis de ADN en el cebador, utilizando dNTPs suministrados en la reacción, y copiará el ARNm en ADN complementario, ADNc abreviado. El ARNm se degrada por la actividad de la RNasa H asociada a la transcriptasa inversa y por el tratamiento posterior con álcali.

b. Síntesis de la segunda cadena: Para que el cebador haga la segunda cadena de ADN (equivalente en secuencia al ARNm original), se puede utilizar una horquilla transitoria al final del ADNc. (La base para su formación no es cierta.) En otros esquemas, se genera un sitio de unión de cebador y se utiliza un cebador dirigido a ese sitio; una forma de hacerlo es mediante la cola de homopolímero del ADNc seguido del uso de un cebador complementario. También se pueden usar cebadores aleatorios para la síntesis de la segunda cadena; aunque esto impide la generación de un ADNc de longitud completa (es decir, una copia del ARNm completo). Sin embargo, es raro generar copias dúplex de todo el ARNm por cualquier medio.

La ADN polimerasa (por ejemplo, la polimerasa Klenow) se utiliza para sintetizar la segunda cadena, complementaria al ADNc. El producto es ADNc dúplex.

Si la horquilla se utilizó para cebar la síntesis de la segunda cadena, debe ser abierta por una nucleasa específica monocatenaria como la S1.

c. Inserción del ADNc dúplex en un vector de clonación:

Un método es usar desoxinucleotidil-transferasa terminal para añadir un homopolímero tal como poli-dC a los extremos del ADNc dúplex y un homopolímero complementario tal como poli-DG al vector.

Un enfoque alternativo es usar enlazadores; estos pueden emplearse de manera que un enlazador que porta un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción esté en el extremo 5' del ADNc dúplex y un enlazador que porta un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción diferente esté en el extremo 3'. (En este contexto, 5' y 3' se refieren a la cadena no plantilla o “superior”). Esto permite la clonación “forzada” en el vector, y uno tiene información inicial sobre la orientación, basada en la proximidad a un sitio de escisión u otro.

El ADNc y el vector se unen en los extremos, utilizando ADN ligasa, para formar plásmidos de ADNc recombinantes (o fagos).

d. Los plásmidos de ADNc ligados se transforman luego en E. coli. El conjunto resultante de transformantes es una biblioteca de clones de ADNc.

Métodos de cribado para clones de ADNc

a. Examen de fuerza bruta de plásmidos de ADNc individuales.

Si el ARNm es muy abundante en un tejido dado, entonces muchos de los clones de ADNc serán copias de ese ARNm. Se puede examinar el ADN de clones individuales y probar los patrones de escisión de restricción característicos o una secuencia particular. Este fue un enfoque común para el cribado de ADNc en los primeros días de la tecnología de ADN recombinante.

A partir de mediados de la década de 1990, los esfuerzos cooperativos de corporaciones (como Merck) y centros genómicos financiados con fondos públicos (como en la Universidad de Washington) han generado la secuencia de clones individuales de grandes bibliotecas de ADNc de muchos tejidos de humanos, ratones y ratas. Otros consorcios han secuenciado bibliotecas de ADNc de otras especies. Cada secuencia se denomina “etiqueta de secuencia expresada” o EST. Estos son ahora una fuente principal de clones de ADNc parcial o completamente caracterizados. Cientos de miles de EST están disponibles, y contienen en parte de la secuencia de ADN de muchos, si no la mayoría, genes humanos. El sitio web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) es un excelente recurso para examinar las EST.

b. Hibridación con una sonda específica de genes.

Si se conoce la secuencia del ADNc deseado, o si se conoce la secuencia de homólogos de especies relacionadas, se pueden usar oligonucleótidos sintéticos (u otra fuente de la secuencia de diagnóstico) como sonda de hibridación radiomarcada para identificar el ADNc de interés.

Si la secuencia de aminoácidos se ha determinado para todo o incluso solo partes del producto proteico del gen de interés, entonces se pueden sintetizar químicamente oligonucleótidos basados en el código genético de esos aminoácidos. Los oligonucleótidos necesitan tener al menos 18 nucleótidos o más (para que se hibriden con sitios específicos en el genoma), y debido a que el código genético es degenerado (más de un codón por aminoácido; discutido en la Segunda Parte), también tienen que ser degenerados. Los oligonucleótidos pueden usarse directamente como sondas de hibridación, aunque cada vez es más común amplificar la región entre dos oligonucleótidos usando la reacción en cadena de la polimerasa, y usar ese producto de amplificación como sonda marcada.

El proceso de cribado de hibridación se ilustra esquemáticamente en la Figura 3.16. Las colonias de bacterias, cada una con un único plásmido de ADNc, se transfieren a un sustrato sólido (como una membrana de nylon o nitrocelulosa), se lisan y el ADN liberado se inmoviliza sobre la membrana. La hibridación de esta membrana (con el ADN unido) a una sonda específica permite cribar a través de miles de colonias en un solo experimento.

Figura\(\PageIndex{2}\): Cribado de hibridación

c. Expresar el ADNc, es decir, hacer el producto proteico codificado por el ARNm, y cribar para ese producto proteico (Figura\(\PageIndex{3}\)). Esto ocurre a menudo en bacterias mediante la construcción de los clones en un vector que tiene un promotor activo de E. coli (para la transcripción) y señales de traducción eficientes aguas arriba del sitio en el que se insertaron los ADNc. Las células bacterianas transformadas expresarán la proteína codificada, y se intentará identificarla. También se puede cribar para la expresión en células de levadura, plantas o mamíferos. El vector de expresión tiene que contener señales reguladoras génicas (tales como promotores y potenciadores, ver Parte Tres) que permitan la expresión del gen deseado en la célula apropiada.

Figura\(\PageIndex{3}\): Cribado para un producto génico expresado

1. Se pueden usar antisueros específicos para detectar la colonia deseada que expresa el gen de interés.
2. Se puede usar un ligando marcado que se unirá al ADNc expresado en la superficie celular. Por ejemplo, los ADNc para receptores pueden expresarse en una célula apropiada (normalmente células de mamífero en cultivo) e identificarse por la capacidad recién adquirida para unirse a una hormona marcada (tal como la hormona del crecimiento o la eritropoyetina).
3. por complementación de una mutación conocida en el hospedador. Por ejemplo, se aisló un ADNc para el homólogo humano a la levadura p34 cdc2 por su capacidad para complementar un mutante de levadura que había perdido la función de este regulador clave del progreso a través del ciclo celular.
4. La clonación de la expresión se puede hacer en células de mamífero, siempre y cuando se pueda seleccionar una nueva función generada por la expresión. El uso de este método para aislar el receptor de la hormona glicoproteica eritropoyetina se ilustra en la Figura\(\PageIndex{4}\).

Figura\(\PageIndex{4}\): Cribado de expresión en células eucariotas.

d. Análisis diferencial:

A menudo uno está interesado en encontrar todos los genes (o sus ARNm) que se expresan de manera única en algún estado diferenciado o inducido de las células. Dos ejemplos clásicos son (i) identificar los genes cuyos productos regulan el proceso de determinación que hace que una línea celular multipotencial de ratón (como las células 10T1/2) se diferencie en células musculares, y (ii), utilizando el hecho de que el receptor de células T se expresa solo en linfocitos T, pero no en su hermana Linfocitos B de linaje, para ayudar a aislar clones de ADNc para ese ARNm. Ambos proyectos utilizaron hibridación sustractiva para enriquecer altamente los clones de ADNc de interés.

En esta técnica, el ADNc de la célula diferenciadora o inducida de interés se hibrida con ARNm de una línea celular relacionada, pero que no ha sufrido la etapa clave de diferenciación. Esto permite eliminar dúplex de ARNm-ADNc que contienen los ADNc para todos los genes expresados en común entre los dos tipos de células. Los monocatenarios resultantes se enriquecen para los ADNc que están involucrados en el proceso en estudio.

El esquema de hibridación sustractiva utilizado en el aislamiento del gen de determinación muscular myoD se ilustra en la Figura\(\PageIndex{5}\).

Una estrategia conceptualmente equivalente, usando PCR (ver siguiente sección) en lugar de clonación de ADNc, es la presentación diferencial de productos de PCR a partir de células que difieren por algún proceso (por ejemplo, diferenciación, inducción, detención del crecimiento versus estimulación, etc.). En esta técnica, se utilizan varios conjuntos de cebadores de PCR hibridados con ADNc a ARNm de los dos tipos de células que se están comparando. Los conjuntos de cebadores están diseñados empíricamente para permitir que se amplifiquen muchas regiones de ADNc. Los productos de amplificación se resuelven (o muestran) en geles de poliacrilamida, y los productos específicos del tipo celular de interés se aíslan y se utilizan para cribar a través de bibliotecas de ADNc. Esta técnica también se denomina análisis de diferencia representacional.

Figura\(\PageIndex{5}\): Cribado diferencial para encontrar ADNc de ARNm expresados solo en ciertos tipos de células.

El advenimiento de la secuenciación de todos o un número muy grande de genes de diversos organismos (por ejemplo, E. coli, levadura, Drosophila, humanos) ha permitido el desarrollo de matrices de microchips de alta densidad de ADN de cada gen. Se puede hibridar ARN de células o tejidos de interés, aislados bajo diversas condiciones metabólicas, para identificar todos los genes (conocidos) expresados. Aún más útiles son los ensayos para genes cuya expresión cambia durante un cambio en el metabolismo celular (ciclo celular, choque térmico, inducción hormonal, etc.) o como resultado de la mutación de algún otro gen (por ejemplo, un gen que codifica un factor de transcripción de interés). Esta poderosa nueva tecnología se está utilizando cada vez más para examinar los efectos globales en la expresión génica.

Para una descripción (y película) del GeneCHIP de Affymetrix, vaya a http://www.affymetrix.com/technology/index.html