3.8: Estructura de genes eucariotas

Mucho se puede aprender sobre cualquier gen después de haber sido aislado por técnicas de ADN recombinante. Se puede deducir la estructura de las regiones codificantes y no codificantes, la secuencia de ADN y más. Esto es cierto para los genes bacterianos y virales, así como para los genes celulares eucariotas. Las siguientes secciones de este capítulo se centrarán en el análisis de genes eucariotas, mostrando el poder de examinar copias purificadas de genes.

Dividir genes e intrones

Precursores de ARNm más largos que ARNm

Las indicaciones iniciales de una estructura compleja para genes eucariotas provinieron del análisis de ARN nucleares durante la década de 1970, y se encontró que los precursores del ARN mensajero, o pre-ARNm, eran sorprendentemente largos, considerablemente mayores que el tamaño promedio del ARNm (Figura\(\PageIndex{1}\)).

Figura\(\PageIndex{1}\)

Los gradientes de sacarosa desnaturalizantes (con alta concentración de formamida, por ejemplo > 50%) separan los ARN en función del tamaño. El análisis del ARN nuclear mostró que el tamaño promedio fue mucho mayor que el tamaño promedio del ARN citoplásmico. El ARN marcado podría ser “perseguido” desde el núcleo hasta el citoplasma, es decir, el ARN nuclear era un precursor del ARNm y otros ARN citoplásmicos. ¿Estaba el ARN extra en los extremos? o en medio del pre-mRNA? Más precisamente, se podrían examinar ARN específicos hibridando fracciones de los gradientes de sacarosa desnaturalizantes a copias marcadas de, por ejemplo, ARNm de globina. El ARN de hibridación del núcleo fue aproximadamente 11S (así como el mensaje 8S maduro), mientras que el ARN citoplásmico de aproximadamente 8S hibridó. Así, el ARN nuclear que codifica globina es mayor que el ARNm citoplásmico.

La visualización de heterodúplex de ARNm-ADN reveló secuencias adicionales internas a los segmentos codificantes de ARNm

Los bucles R son híbridos entre ARN y ADN que se pueden visualizar en la EM, bajo condiciones en las que los dúplex de ADN‑ARN se ven favorecidos sobre los dúplex de ADN‑ADN (Figura\(\PageIndex{2}\)). Para una estructura génica simple, se ve un dúplex continuo de ARN‑ADN (suave, que se curva lentamente) y una sola hebra desplazada de ADN (más delgada, muchas más vueltas y curvas: el ADN monocatenario no es un ácido nucleico rígido como bicatenario, ya sea ADN dúplex o ARN-ADN).

Figura\(\PageIndex{2}\)

Las imágenes EM de dúplex entre los ARNm de adenovirus purificados y el ADN genómico mostraron extensiones en los extremos 3' (poli A) y 5', que se codifican en otra parte del genoma. Todos los ARNm tardíos tienen la misma secuencia en el extremo 5'; esto se deriva del líder tripartito. Los bucles R entre los ARNm tardíos y los fragmentos de ADN de adenovirus, incluido el promotor tardío principal, mostraron dúplex con los segmentos líderes, separados por bucles de ADN dúplex (Figura 3.23, panel inferior). Los híbridos ARN-ADN identifican regiones de ADN que codifican ARN. El resultado sorprendente es que las porciones codificadoras de ARN de un gen están separadas por bucles de ADN dúplex en el análisis de bucle R. En la Figura se muestran ejemplos de bucles R en genes con intrones\(\PageIndex{3}\).

Estos datos mostraron que los ARN de adenovirus están codificados en diferentes segmentos del genoma viral; es decir, los genes están divididos. La porción de un gen que codifica ARNm se denominó exón. La parte del gen no codifica para secuencias en el ARNm maduro se llama intrón. Estas observaciones llevaron al Premio Nobel para Phil Sharp y Rich Roberts. Louise Chow y Sue Berget también fueron actores clave en el descubrimiento de intrones.

Figura\(\PageIndex{3}\): Bucles R entre clones de genes de globina tipo beta de conejo (ahora llamados HBe y HBG) y ARNm de células eritroides embrionarias de conejo. Una fotografía del microscopio electrónico se muestra en la parte superior de cada panel, y debajo de él se incluye un dibujo interpretativo. La cadena desplazada de ADN no molde forma dúplex parciales o completos con la cadena molde en el intrón grande. Un intrón pequeño también es visible en el panel C. El panel G muestra los dos genes juntos en un clon grande.

Posteriormente se descubrieron interrupciones en los genes celulares, a fines de la década de 1970, en genes de globina, genes de inmunoglobulina y otros. Ahora nos damos cuenta de que la mayoría de los genes en eucariotas complejos están divididos por múltiples intrones.

Los exones están más conservados que los intrones (en la mayoría de los casos), ya que se seleccionan contra las alteraciones en las regiones codificantes de proteínas que alteran o disminuyen la función, mientras que muchas secuencias en los intrones pueden alterarse sin afectar la función del producto génico. Secuencias importantes en intrones (tales como uniones de empalme, el punto de ramificación y potenciadores ocasionales) se cubren con cierto detalle en la Tercera Parte.

Las diferencias en los mapas de resticción entre ADNc y clones genómicos revelan intrones

Los mapas de restricción basados en copias del ARNm (ADNc) fueron diferentes de los del ADN genómico; los genes fueron escindidos por algunas endonucleasas de restricción que los ADNc no estaban, y algunos sitios de restricción estaban más separados en el ADN genómico. Estas observaciones se explicaron por la presencia de secuencias intermedias o intrones (Figura\(\PageIndex{4}\)).

Figura\(\PageIndex{4}\)

Los procedimientos experimentales para hacer esto implican hacer un mapa de restricción de los clones de ADN genómico, y luego identificar las regiones que codifican ARNm mediante hibridación de sondas de ADNc marcadas con los digestos de restricción. ADN genómico clonado digerido con endonucleasas de restricción apropiadas, separado por tamaño en un gel de agarosa, y luego transferido a un soporte sólido de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia Southern se hibrida luego con una sonda marcada específica para el ADNc (compuesta solo por exones). El patrón de fragmentos marcados en el autorradiograma resultante muestra los fragmentos que contienen exones. El alineamiento de estos con el mapa de restricción del gen da una aproximación de la posición de los exones.

El enfoque de hibridación por transferencia se puede combinar con un análisis de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para mayor resolución. Se sintetizan cebadores que hibridarán con exones adyacentes. La diferencia de tamaño del producto de amplificación por PCR entre el ADN genómico y el ADNc es el tamaño del intrón. El producto de PCR puede clonarse y secuenciarse para obtener información más detallada, por ejemplo, para definir con precisión las uniones exón/intrón.

Posteriormente, se determina la secuencia de nucleótidos de las regiones exónicas y preferiblemente del gen completo. Se confirmó la presencia de intrones y sus localizaciones se definieron precisamente en secuencias de ADN de clones aislados de los genes.

Tipos de Exones

Los genes eucariotas son una combinación de intrones y exones. Sin embargo, no todos los exones hacen lo mismo (Figura\(\PageIndex{5}\)). En particular, las regiones codificantes de proteínas o genes son un subconjunto de las secuencias en los exones. Los exones incluyen tanto las regiones no traducidas como las regiones traducidas codificantes de proteínas. Los intrones son los segmentos de genes que están presentes en el transcrito primario (o ARN precursor) pero que se eliminan por corte y empalme en la producción de ARN maduro. Los métodos utilizados para detectar regiones codificantes no encontrarán todos los exones.

Figura\(\PageIndex{5}\): Tipos de exones