3.E: Aislamiento y Análisis de Genes (Ejercicios)

3.2 Alterar los extremos de los fragmentos de ADN para la ligación en vectores.

(Adaptado de POB)

a) Dibujar la estructura del extremo de un fragmento de ADN lineal que se generó digiriendo con la endonucleasa de restricción Eco RI. Incluir aquellas secuencias restantes de la secuencia de reconocimiento EcoRI.

b) Dibujar la estructura resultante de la reacción de esta secuencia final con la ADN polimerasa I y los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos.

c) Dibujar la secuencia producida en la unión si se ligan dos extremos con la estructura derivada en (b).

d) Diseñar dos fragmentos de ADN sintéticos cortos diferentes que permitan la ligación de la estructura (a) con un fragmento de ADN producido por una digestión de restricción PstI. En uno de estos fragmentos sintéticos, diseñe la secuencia de manera que la unión final contenga las secuencias de reconocimiento tanto para Eco RI como para Pst I. Diseñe la secuencia del otro fragmento para que ni la secuencia Eco RI ni la Pst I aparezcan en la unión.

3.3. ¿Qué propiedades se requieren de los vectores utilizados en la clonación molecular del ADN?

3.4. Un estudiante ligó un fragmento BamHI que contenía un gen de interés a un vector pUC digerido con BamHI, transformó E. coli con la mezcla de productos de ligación y sembró las células en placas que contenían el antibiótico ampicilina y el sustrato cromogénico X‑gal. ¿Qué colonias debe elegir el estudiante para encontrar las que contienen el plásmido recombinante (con el gen de interés en pUC)?

3.5. Comenzando con un ARNm aislado, se desea hacer una copia bicatenaria del ARNm e insertarlo en el sitio PstI de pBR322 mediante cola de homopolímero G-C. Luego se transforma E. coli con este plásmido recombinante, seleccionando resistencia a tetraciclina. ¿Cuáles son los cuatro pasos enzimáticos utilizados en la preparación del inserto de ADNc? Nombrar las enzimas y describir los intermedios.

3.6 Una investigadora necesita aislar un clon de ADNc de ARNm de actina de jirafa, y conoce el tamaño (Mr = 42,000) y la secuencia parcial de aminoácidos de la proteína actina de jirafa y tiene anticuerpos específicos contra la actina de jirafa. Después de construir un banco de plásmidos de ADNc a partir del ARNm total de fibroblastos de jirafa (Dg-dC colado en el sitio PstI de pBR322), ¿qué métodos de cribado del banco podrían usarse para identificar el clon de ADNc de actina?

3.7 El mapa de restricción de pBR322 es

La distancia en pares de bases entre los sitios de restricción es la siguiente:

PstI a EcoRI 750 pb

EcoRI a HindIII 50 pb

HindIII a BamHI 260 pb

BamHI a PstI 3300 pb

Un plásmido de ADNc recombinante, pALC-1, tiene ADNc bicatenario insertado en el sitio PstI de pBR322, utilizando una técnica que conserva este sitio de escisión en ambos extremos del inserto. La digestión de pBR322 y pALC-1 con endonucleasas de restricción da el siguiente patrón después de la electroforesis en gel (izquierda). Los tamaños de los fragmentos se dan en pares de bases. Los fragmentos de ADN se transfirieron del gel a nitrocelulosa y se hibridaron con ADNc radiomarcado de A. latrobus de tipo silvestre (una hibridación Southern blot-hybridizaton). Los fragmentos de hibridación se muestran en el diagrama autoradiogam a la derecha.

a) ¿Cuál es el tamaño del inserto de ADNc?

b) ¿Qué dos endonucleasas de restricción escinden dentro del inserto de ADNc?

c) Para esas dos endonucleasas de restricción, cada fragmento de ADN en la digestión simple es cortado por Pst I en dos fragmentos de ADN en la digestión doble (es decir, la endonucleasa de restricción más Pst I). Determine en qué fragmentos se corta cada fragmento de digestión individual y use esta información para construir un mapa.

d) Dibujar un mapa de restricción para pALC-1, mostrando sitios para Pst I, Eco RI, Bam HI y Hind III. Indicar la distancia entre sitios y mostrar claramente el inserto de ADNc.

3.8. Se aísla y clona un fragmento Kpn I del ADN genómico de A. latrobus que codifica el ARNm clonado en pALC-1 (como se analizó en la pregunta 3.7). El mapa de restricción del fragmento genómico es

Cada fragmento que hibrida con pALC-1 se indica con un asterisco. ¿Qué te dice este mapa, especialmente cuando se compara con el del problema 3.7, sobre la estructura del gen? Ser lo más cuantitativo posible.

3.9. Alguna enzima particular está compuesta por una cadena polipeptídica de 192 aminoácidos. El gen que lo codifica tiene 1,440 pares de nucleótidos. Explicar la relación entre el número de aminoácidos en este polipéptido y el número de pares de nucleótidos en su gen.

3.10. Cuando se ve en el microscopio electrónico, un híbrido entre un gen de actina de jirafa clonado (ADN genómico) y ARNm de actina madura se ve así:

¿Qué se puede concluir sobre la estructura del gen de actina en la jirafa?

3.11. El ADN complementario al ARNm de pimiento se sintetizó utilizando oligo (dT) como cebador para la síntesis de la primera cadena. Luego se sintetizó la segunda cadena (sinónimo del ARNm) y la población de ADNc bicatenarios se ligaron en un vector plasmídico mediante un procedimiento que deja sitios PstI flanqueando el inserto de ADNc (es decir, los sitios PstI terminales para cada clon no forman parte del ADNc). Esta biblioteca de ADNc se cribó para detectar clones elaborados a partir del ARNm del gen amarillo pimienta. Se aisló un clon, y el análisis posterior del patrón de los patrones de escisión de endonucleasas de restricción mostró que tenía la siguiente estructura:

El mapa muestra las posiciones de los sitios de escisión de endonucleasas de restricción y la distancia entre ellos en kilobases (kb). El mapa del inserto de ADNc se muestra con líneas continuas, y el ADN del vector plasmídico que flanquea el ADNc se muestra como líneas punteadas. La hebra superior está orientada 5' a 3' de izquierda a derecha, y la cadena inferior está orientada 5' a 3' de derecha a izquierda. Se muestran las posiciones y orientaciones de dos oligonucleótidos para cebar la síntesis para la determinación de la secuencia, y se colocan adyacentes a la cadena que se sintetizará en la reacción de secuenciación.

a) Los oligonucleótidos que se hibridan con las secuencias del vector plasmídico que flanquean el inserto de ADNc dúplex se utilizaron para cebar la síntesis de ADN para la secuenciación mediante el procedimiento de didesoxinucleótidos de Sanger. Un cebador que se hibridó con las secuencias del vector a la izquierda del mapa mostrado arriba generó el patrón de gel de secuenciación que se muestra a continuación a la izquierda. Un cebador que se hibridó con las secuencias del vector a la derecha del mapa mostrado anteriormente generó el patrón de gel de secuenciación que se muestra a continuación a la derecha. Los geles se corrieron desde el electrodo negativo en la parte superior hasta el electrodo positivo en la parte inferior, y el segmento presentado pasa por el sitio PstI (es decir, no busca un sitio de reconocimiento PstI).

Imprimación izquierda Primer derecho

G	A	T	C			G	A	T	C
		____					____
	____							____
____								____
	____							____
		____							____
			____			____
		____							____
			____			____
			____			____
____							____
____								____
	____							____
____								____
____								____
____								____
____								____
____								____
____								____
____								____

a) ¿Cuál es la secuencia de ADN de los extremos izquierdo y derecho del inserto en el clon de ADNc? Asegúrese de especificar la orientación de 5' a 3', y la hebra (superior o inferior) cuya secuencia se reporta. Los términos izquierda, derecha, arriba e inferior se refieren al mapa mostrado anteriormente para el clon de ADNc.

b) ¿Qué extremo del clon de ADNc (izquierdo o derecho en el mapa anterior) es más probable que incluya la secuencia sinónimo del extremo 3' del ARNm?

c) ¿Qué sitios de escisión de endonucleasas de restricción ve en los datos de secuenciación dados?

3.12. El ADN genómico de la planta de pimiento se ligó en sitios EcoRI en un vector de fago l para construir una biblioteca de ADN genómico. Esta biblioteca se cribó mediante hibridación con el clon amarillo de ADNc. El patrón de sitios de escisión EcoRI para un clon que hibridó con el clon amarillo de ADNc se analizó en dos experimentos.

En el primer experimento, el clon de ADN genómico se digirió hasta completarse con EcoRI, los fragmentos se separaron en un gel de agarosa, se transfirieron a un filtro de nylon y se hibridaron con el clon de ADNc amarillo radiactivo. El patrón de digestión (observado en el gel de agarosa) se muestra en el carril 1, y el patrón de fragmentos de hibridación (observado en un autorradiograma después de la hibridación) se muestra en el carril 2. Los tamaños de los fragmentos EcoRI se indican en kb. El brazo derecho de este vector l es de 6 kb de largo y el brazo izquierdo es de 30 kb.

En el segundo experimento, el clon de ADN genómico se digirió con un rango de concentraciones de EcoRI, de manera que los productos variaron desde una digestión parcial hasta una digestión completa. Los productos de escisión se hibridaron con un oligonucleótido radiactivo que hibridó solo con el extremo cohesivo derecho (sitio cos) del ADN del vector l. Esto simplemente coloca una etiqueta radiactiva en el extremo derecho de todos los productos de la reacción que se extienden hasta el extremo derecho del clon l (parcial o completo); no se verán productos de digestión que no incluyan el extremo derecho del clon l. Los resultados de la digestión se muestran arriba, a la derecha. El carril 1 es el clon de ADN genómico en l que no ha sido digerido, el carril 5 es el digesto completo con EcoRI, y los carriles 2, 3 y 4 son digestiones parciales usando cantidades crecientes de EcoRI. Se dan los tamaños de los fragmentos de ADN radiactivo (en kb), y la densidad del relleno en las cajas es proporcional a la intensidad de la señal en el autorradiograma.

a) ¿Cuál es el mapa de los fragmentos EcoRI en el clon de ADN genómico y qué fragmentos codifican ARNm para el gen amarillo? Es posible que desee rellenar la siguiente figura; se dan los brazos izquierdo y derecho del vector l. Mostrar posiciones de los sitios de escisión EcoRI, distancias entre ellos (en kb) e indicar los fragmentos que hibridan con el clon de ADNc.

EcoRI EcoRI

Brazo izquierdo ___| |_ Brazo derecho

(30 kb) (6 kb)

En un tercer experimento, se escindió el ADN de pimiento del clon de ADN genómico, se hibridó con ARNm amarillo en condiciones que favorecen los dúplex ARN-ADN y se examinó en el microscopio electrónico para visualizar los bucles R. Se observó un patrón como el siguiente. Las líneas en la figura pueden ser ADN dúplex, dúplex ARN-ADN y ADN monocatenario.

b) ¿Qué indican los datos del bucle R? Por favor, dibuje una interpretación de los bucles R, mostrando claramente las dos cadenas de ADN y el ARNm y distinguiendo entre las cadenas molde (inferior, o mensaje complementario) y no plantilla (superior, o sinónimo de mensaje).

Los fragmentos EcoRI que hibridan con el clon amarillo de ADNc fueron aislados y digeridos con SalI (S en la figura siguiente), HindIII (H) y la combinación de SalI más HindIII (S+H). Los patrones resultantes de fragmentos de ADN se muestran a continuación; todos hibridarán con el clon amarillo de ADNc. La escisión del fragmento EcoRI de 5 kb con SalI genera dos fragmentos de 2.5 kb.

c) ¿Cuáles son los mapas del sitio o sitios SalI y HindIII en cada uno de los fragmentos EcoRI? Muestra las posiciones de los sitios de escisión y las distancias entre ellos en el siguiente diagrama.

Fragmento EcoRI de 5 kb: fragmento EcoRI de 4 kb:

EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

|___________________________| |___________________________|

d) Comparar estos mapas de restricción con el del clon de ADNc (problema 1.38) y los bucles R mostrados anteriormente. Suponiendo que los sitios SalI y HindIII en el ADN genómico corresponden a los del clon de ADNc, ¿qué se puede deducir sobre la estructura intrón/exón del gen o genes amarillos contenidos dentro de los fragmentos EcoRI de 5 kb y 4 kb? Diagrama la estructura exón-intrón con el mayor detalle que permitan los datos (es decir, mostrar el tamaño del intrón o intrones y las posiciones de las uniones intrón/exón con la mayor precisión posible).

Fragmento EcoRI de 5 kb: fragmento EcoRI de 4 kb:

EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

|___________________________| |___________________________|

e) Considerando todos los datos (mapas de ADNc y clones genómicos y análisis de bucle R), ¿qué se puede concluir sobre el número y ubicación (es) de gen (es) amarillo (es) en este clon genómico?

3.13 Se ha aislado un clon de ADNc de 1100 pares de bases (pb) para un gen llamado azure que cuando muta provoca ojos azules en las ranas. También se aísla un fragmento de ADN genómico Sal I de 3000 pb que se hibrida con el ADNc azul. El mapa del ADNc azul es el siguiente, con tamaños de fragmentos dados en pb.

La digestión del fragmento SalI de 3000 pb del ADN genómico con las endonucleasas de restricción indicadas produce el siguiente patrón de fragmentos, todos los cuales hibridan con el ADNc azul. Recuerde que el fragmento inicial tiene sitios Sal I en cada extremo. Los tamaños de los fragmentos están en pb.

Enzimas de restricción

BamHi Bam+Pst PstI Ps+Eco EcoRI Bam+Eco

2700

2300

2000

1900 1900

1200

1100 1100

800

700 700 700

300 300 300

El fragmento genómico Sal I a Sal I (3000 pb) se hibridó con el fragmento de ADNc de 1100 pb, y los heterodúplex se examinaron en el microscopio electrónico. Las mediciones en un gran número de moléculas dieron como resultado la determinación de los tamaños indicados en la estructura de la izquierda, es decir, las regiones dúplex de 400 y 600 pb están interrumpidas por un bucle monocatenario de 1500 nucleótidos y están flanqueadas por regiones monocatenarias de 500 y 100 nucleótidos. Cuando se realiza el mismo experimento con el fragmento de ADN genómico Sal I a Eco RI de 2700 pb hibridado con el fragmento de ADNc, se observa la estructura de la derecha.

a) ¿Cuál es el mapa de restricción del fragmento de ADN genómico Sal I a Sal I de 3000 pb del gen azure? Especifique las distancias entre sitios en pares de bases.

b) ¿Cuántos intrones están presentes en el fragmento de ADN genómico azul?

c) ¿Dónde están los exones en el fragmento de ADN genómico azul? Dibujar los exones como casillas en el mapa de restricción del fragmento de ADN genómico Sal I a Sal I de 3000 pb? Especifique (en pares de bases) las distancias entre los sitios de restricción y los límites intrón/exón.

3.14 El receptor de células T está presente solo en los linfocitos T, no en los linfocitos B u otras células. Describir una estrategia para aislar el receptor de células T mediante hibridación sustractiva, utilizando ARN de linfocitos T y de linfocitos B.

3.15. ¿Cuántos exones hay en el gen de la insulina humana (INS), qué tan grandes son y qué tan grandes son los intrones que los separan? Utilice tres enfoques bioinformáticos diferentes para responder a esto.

a. Alinear la secuencia genómica disponible que contiene INS (que codifica insulina) con la secuencia del ARNm para encontrar exones e intrones en el gen INS. Los archivos de secuencia son:

ARNm del INS: número de acceso NM_000207

Gen INS (incluye parte de TH e IGF2 además del INS): número de acceso L15440

Los archivos se pueden obtener de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), o del sitio web del curso (www.bmb.psu.edu/cursos/bmb400/default.htm)

Alinee el ARNm (ADNc) y la secuencia genómica usando el servidor de secuencias BLAST2 en

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

y el servidor sim4 en

pbil.univ-lyon1.fr/sim4.html

Sim4 está diseñado para tener en cuenta la redundancia terminal en las uniones exón/intrón, mientras que BLAST2 no. ¿Ves este efecto en la salida?

b. Utilice el programa de búsqueda de exones ab initio Genscan, disponible en

Genes.mit.edu/genscan.html

para predecir exones en la secuencia genómica del INS (L15440).

¿Cómo se compara esto con los resultados de analizar con el programa genscan?

c. ¿Qué ves para el INS en el Navegador Genoma Humano y Ensembl? Se accede a ellos en:

http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html

http://www.ensembl.org/