3.10: Análisis funcional de genes aislados
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Expresión génica
“Northern blots” o hibridación de transferencia de ARN
Al revés de las hibridaciones de transferencia Southern, se pueden separar los ARN por tamaño en un gel de agarosa desnaturalizante y transferirlos a nylon u otro soporte sólido apropiado. El ADN marcado puede entonces usarse para visualizar el ARNm correspondiente (Figura 3.33). Ed Southern utilizó inicialmente ARNr marcado para encontrar las regiones complementarias en ADN inmovilizado y digerido, por lo que este “reverso” de las hibridaciones de transferencia Southern, es decir, usar una sonda de ADN marcada para hibridar con ARN inmovilizado, a menudo se conoce como hibridaciones de transferencia “Northern”.
Se puede hibridar un clon de ADN marcado con un panel de muestras de ARN de una amplia variedad de tejidos para determinar en qué tejidos se expresa un gen clonado particular (panel superior de la Figura 3.33. Más precisamente, esta técnica revela los tejidos en los que los genes se transcriben en ARN estable. Los resultados permiten determinar la especificidad tisular de expresión, por ejemplo, un gen solo puede expresarse en el hígado, o solo en células eritroides (por ejemplo, el gen de la b-globina). Esto ayuda a dar alguna idea general de la posible función del gen, ya que debe reflejar la función de ese tejido. Otros genes se expresan en casi todas las células o tipos de tejidos (como GAPDH); estos se denominan genes constitutivos. Están involucrados en funciones comunes a todas las células, como el metabolismo energético básico, estructura celular, etc. Las cantidades relativas de ARN en los diferentes carriles se pueden comparar directamente para ver, por ejemplo, qué tejidos expresan el gen más abundantemente.
Se puede hibridar un clon de ADN marcado con un panel de muestras de ARN de etapas progresivas de desarrollo para determinar la etapa de desarrollo cuando durante el desarrollo un gen clonado particular se expresa como ARN (panel inferior de la Figura 3.33). Por ejemplo, un producto génico puede ser requerido para las decisiones de determinación tempranas en el desarrollo, y solo se expresa en embriones tempranos.
Una vez que se conoce la secuencia de ADN del gen de interés y se determina su estructura intrón-exón, se pueden diseñar ensayos de RT-PCR altamente sensibles (Figura 3.34). El ARN de la célula o tejido de interés se copia en ADNc usando transcriptasa inversa y dNTPs, y luego los cebadores se hibridan para PCR. Idealmente, los cebadores están en diferentes exones de manera que el producto de amplificar el ADNc será menor que el producto de amplificar el ADN genómico.
Hibridaciones in situ/Inmunoquímica
En enfoques complementarios, el ADN marcado puede hibridarse in situ con secciones delgadas de un tejido o embrión u otro espécimen, y el patrón resultante de granos visualizado a lo largo del espécimen en el microscopio (Figura 3.35). Además, se pueden utilizar sondas de anticuerpos contra el producto proteico para localizarlo en el espécimen. Esto da una imagen más detallada del patrón de expresión, con resolución a las células particulares que están expresando el gen. Las técnicas de hibridación por transferencia de ARN descritas en a. anterior analizan el ARN en todas las células de un tejido, y no proporcionan el nivel de resolución a células individuales.
Microarrays
A medida que se dispone de un gran número de ARNm y genes secuenciados, se ha desarrollado tecnología para observar la expresión de un gran número de genes de manera simultánea. Las secuencias de ADN específicas para cada gen en una bacteria o levadura pueden ser manchadas en una matriz de alta densidad con 400 r más manchas. Algunas tecnologías utilizan muchos más spots, con múltiples secuencias por gen. Microarrays, o “chips génicos” están disponibles para muchas especies, algunas con decenas de miles de secuencias o “sondas” diferentes. El ARN de diferentes tejidos se puede convertir en ADNc con una etiqueta fluorescente distintiva, y luego hibridarse con el chip génico. Se pueden medir las diferencias en el nivel de expresión. Así, ahora se pueden medir los cambios globales en la expresión génica.
Búsquedas en bases de datos
Un enfoque cada vez más poderoso es determinar candidatos para la función de su gen mediante la búsqueda en las bases de datos con la secuencia, buscando coincidencias con proteínas y genes conocidos. Estos partidos proporcionan pistas en cuanto a la función de las proteínas.
El poder de este enfoque aumenta a medida que se expande la cantidad de secuencias depositadas en las bases de datos. Ya se conocen secuencias de muchos genes. Los genes secuenciados de organismos más complejos, como plantas y animales, tienden a ser los que se aíslan más fácilmente utilizando las técnicas discutidas en la tecnología de ADN recombinante. Sin embargo, las secuencias de genes expresados a un nivel bajo están empezando a acumularse en las bases de datos.
Un avance notable en los últimos años es el creciente número de organismos cuyo genoma completo ha sido secuenciado. Se han secuenciado cerca de 10 genomas bacterianos y el número aumenta cada pocos meses. Las secuencias genómicas para dos eucariotas ya están disponibles. El de la levadura Saccharomyces cerevisiae se conoce desde hace algunos años, y el genoma del nematodo Caenorhabditis elegans se completó en 1998. Estas secuencias están siendo analizadas intensivamente, y una fracción muy alta de todos los genes en cada genoma se puede detectar de manera confiable usando herramientas computacionales (una parte de la bioinformática). Ha quedado claro que muchas de las enzimas utilizadas en el metabolismo básico, regulación del ciclo celular, cascadas de señalización celular, etc. están altamente conservadas a través de un amplio espectro filogenético. Por lo tanto, es común encontrar coincidencias de secuencia significativas en los genomas de organismos modelo cuando son consultados por la secuencia de un gen previamente desconocido, por ejemplo, de humanos o ratones. La función ya establecida para ese gen en gusanos o levaduras es una guía altamente confiable para la función del gen homólogo en humanos. El gusano C. elegans es multicelular y se ha mapeado el destino de cada una de sus células durante el desarrollo. De esta manera es posible que muchas funciones involucradas en las interacciones celulares y la señalización célula-célula sean conservadas en esta especie, ampliando así la lista de dianas potenciales para una búsqueda en las bases de datos.
Este potencial se está realizando a medida que se analizan secuencias borrador de trabajo de los genomas humano y de ratón. Dentro de estos datos se encuentra una buena aproximación de secuencias de prácticamente todos los genes humanos y de ratón. Los clones aleatorios se han secuenciado parcialmente a partir de bibliotecas de ADNc de diversos tejidos humanos, normalizados para eliminar gran parte de los productos de ARNm abundantes y así aumentar la frecuencia de productos de ARNm raros. Estas secuencias de los extremos de los clones de ADNc se denominan e xpressed s equence t ags, o EST. El nombre se deriva del hecho de que al estar en bibliotecas de ADNc, obviamente se expresan a nivel de ARNm, y algunas se utilizan como etiquetas en la generación de mapas de alta resolución de cromosomas humanos. Cientos de miles de estos ya han sido secuenciados en esfuerzos de colaboración entre compañías farmacéuticas, otras empresas y universidades. La base de datos DBest registra todos aquellos en el dominio público, y es un fuerte complemento a las bases de datos que registran todas las secuencias conocidas de genes. Muchas partes diferentes de los mismos ADNc, o altamente relacionados, se registran como entradas separadas en DBest. Se están realizando proyectos para agrupar todas las secuencias del mismo gen (o altamente relacionado) en una secuencia unificada. Un ejemplo es el proyecto Unigene en NCBI. El número de entradas crece continuamente, pero en el verano de 1998 hay alrededor de 50,000 entradas, cada una representando alrededor de un gen. El número es mayor ahora. Las estimaciones actuales del número de genes humanos son alrededor de 30,000, por lo que es posible que algunos clústeres UniGene representen solo partes de genes, y algunos genes coincidan con más de un clúster.
Se han diseñado motores de búsqueda muy eficientes para manejar consultas a estas bases de datos, y varios están disponibles gratuitamente a través de la World Wide Web. Uno de los sitios más populares y útiles para esta y otras actividades relacionadas es mantenido por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Su navegador Entrez proporciona acceso integrado a la secuencia, mapeo y cierta información funcional, PubMed brinda acceso a resúmenes de artículos en revistas de la Biblioteca Nacional de Medicina, y el servidor BLAST permite búsquedas rápidas a través de diversas bases de datos de secuencias. dBest y la colección Unigene son mantenido aquí, muchos mapas del genoma están disponibles, y estructuras tridimensionales de proteínas y ácidos nucleicos están disponibles.
Elaborar el producto proteico y analizarlo
A menudo es posible expresar el gen y producir la proteína codificada en grandes cantidades. La proteína se puede purificar y ensayar para diversas actividades enzimáticas u otras actividades. Las hipótesis para tales actividades pueden provenir de búsquedas en bases de datos.
Mutación dirigida
Los enfoques descritos anteriormente dan alguna idea sobre la función génica, pero no establecen firmemente esas funciones. En efecto, este es un problema moderno de tratar de asignar una función a un gen aislado. Ahora se pueden tomar varios enfoques “genéticos inversos” para abordar este problema. El enfoque más poderoso para determinar el (los) papel (s) fisiológico (s) de un producto génico es mutar el gen en un organismo apropiado y buscar un fenotipo alterado.
El experimento más fácil de hacer, pero a veces más difícil de interpretar, es un ensayo de ganancia de función. En este caso, se fuerza la expresión del gen en un organismo transgénico, que muchas veces ya tiene una copia de tipo salvaje del gen. Se puede buscar un fenotipo resultante de la sobreexpresión en tejidos donde normalmente se expresa, o la expresión ectópica en tejidos donde normalmente es silencioso.
En algunos organismos, es posible diseñar una pérdida de función del gen. El método más efectivo es usar la recombinación homóloga para reemplazar el gen de tipo silvestre con uno diseñado para que no tenga función. Esta mutación knock-out evitará la expresión del gen endógeno y se pueden ver los efectos en todo el organismo. Desafortunadamente, la eficiencia de la recombinación homóloga es baja en muchos organismos y líneas celulares, por lo que esto no siempre es factible. Se están desarrollando otros métodos para noquear la expresión, aunque aún se está estudiando el mecanismo para su efecto (cuando tiene éxito). En algunos casos, se puede bloquear la expresión del gen endógeno forzando la producción de ARN antisentido. Otro método que es efectivo en algunos, pero actualmente no en todos los organismos, es el uso de ARN interferente bicatenario (ARNi). Los ARN dúplex de menos de 30 pares de nucleótidos de longitud del gen de interés pueden prevenir la expresión de genes en gusanos, moscas y plantas. Recientemente se reportó cierto éxito en mamíferos.
Otra forma de generar un fenotipo de pérdida de función es expresar alelos negativos dominantes del gen. Estos alelos mutantes codifican proteínas estables que forman una estructura aberrante que impide el funcionamiento de la proteína endógena. Esto generalmente requiere alguna interacción proteína-proteína (por ejemplo, homodímeros o heterodímeros).
Localización en un mapa genético
En ocasiones el gen que tienes aislado se mapea a una región en un cromosoma con una función conocida. Por supuesto, muchos genes probablemente están localizados en esa región, por lo que es fundamental demostrar que un gen candidato realmente es el que al mutar provoca un fenotipo alterado. Esto se puede hacer demostrando que una copia de tipo salvaje del gen candidato restaurará un fenotipo normal al mutante. Si se sabe que un marcador está muy estrechamente ligado al gen candidato, se puede probar si este marcador está siempre en desequilibrio de ligamiento con el determinante del fenotipo mutante, es decir, en un gran número de cruces, el marcador para el gen candidato y el fenotipo mutante nunca se separaron por recombinación.
El mapeo a menudo se realiza con sondas específicas de genes para hibridaciones in situ con cromosomas mitóticos. Luego se alinea el patrón de hibridación con los patrones de bandas cromosómicas para mapear el gen aislado. Otro método es hibridar con un panel de ADN de células híbridas que contienen solo una parte del complemento cromosómico del genoma de interés. Esto es particularmente potente con paneles híbridos de radiación.