4.1: La cinética de reasociación mide la complejidad de la secuencia
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Las secuencias de ADN de baja complejidad se rehibridan más rápido que las secuencias de alta complejidad
Los componentes de los genomas complejos difieren no solo en la frecuencia de repetición (altamente repetitiva, moderadamente repetitiva, copia única) sino también en la complejidad de secuencia. La complejidad (denotada por N) es el número de pares de bases de ADN único o no repetitivo en un segmento dado de ADN, o componente del genoma. Esto es diferente de la longitud (L) de la secuencia si se repite parte del ADN, como se ilustra en este ejemplo.
Por ejemplo, considere ADN de 1000 pb.
- 500 pb es la secuencia a, presente en una sola copia.
- 500 pb es la secuencia b (100 pb) repetida 5 veces:
a b b b b b
|___________|__|__|__|__|__|__| L = longitud = 1000 pb = a + 5b
N = complejidad = 600 pb = a + b
Algunos genomas virales y bacteriófagos casi no tienen ADN repetido, y L es aproximadamente igual a N. Pero para muchos genomas, el ADN repetido ocupa 0.1 a 0.5 del genoma, como en este sencillo ejemplo. El resultado clave para el análisis del genoma es que las secuencias de ADN menos complejas renaturalizan más rápido que las secuencias más complejas. Determinar así la tasa de renaturalización del ADN genómico permite determinar cuántos componentes cinéticos (secuencias de diferente complejidad) hay en el genoma, qué fracción del genoma ocupa cada uno y la frecuencia de repetición de cada componente.
Antes de investigar esto en detalle, veamos un ejemplo para ilustrar este principio básico, es decir, la relación inversa entre la cinética de reasociación y la complejidad de la secuencia.
Relación inversa entre cinética de reasociación y complejidad de secuencia
Que a, b,... z representen una cadena de pares de bases en el ADN que pueden hibridarse (ver Figura 4.2.). Para simplificar la aritmética, usaremos 10 pb por letra.
- ADN 1 = ab (Esto es muy baja complejidad de secuencia, 2 letras o 20 pb)
- ADN 2 = cdefghijklmnopqrstuv. (Esto es 10 veces más complejo (20 letras o 200 pb)).
- ADN 3 =izyajczkblqfreighttrainrunninsofastelizabethcottonqwftzxvbifyoudondondondondondondonyyyvyoudondondonyylejustcountthe
díassimgonerxcvwpolobajotecrosscarreteraestriadatocatáridoobertjohnsonpzvmwcomeonhomeintomicocinentrad.
(Esto es 100 veces más complejo (200 letras o 2000 pb).
Una solución de 1 mg de ADN/ml es 0.0015 M (en términos de moles de pb por L) o 0.003 M (en términos de nucleótidos por L). Utilizaremos 0.003 M = 3 mM, es decir, 3 milimoles nts por L. (nts = nucleótidos).
Considera una solución de 1 mg/ml de cada uno de los tres ADN. Para el ADN 1, esto significa que la secuencia ab (20 nts) está presente a 0.15 mM o 150 mM (calculada a partir de 3 mM/20 nt en la secuencia). Asimismo, el ADN 2 (200 nts) está presente a 15 mM, y el ADN 3 está presente a 1.5 mM. Fundir el ADN (es decir, disociar en cadenas separadas) y luego permitir que la solución vuelva a aparearse, es decir, dejar que la cadena complementaria se vuelva a asociar.
Dado que la tasa de reasociación está determinada por la velocidad del encuentro inicial entre cadenas complementarias, cuanto mayor sea la concentración de esas cadenas complementarias, más rápido se volverá a asociar el ADN. Entonces, para una concentración de ADN global dada, la secuencia simple (ab) en ADN 1 de baja complejidad se reasociará 100 veces más rápido que la secuencia más compleja (izyajcsk... trad) en el ADN de mayor complejidad 3. La rápida reasociación del ADN es de baja complejidad.
Cinética de renaturalización
En esta sección, desarrollaremos las relaciones entre las tasas de renaturalización, complejidad y frecuencia de repetición de manera más formal.
El tiempo requerido para la mitad de la renaturalización es inversamente proporcional a la constante de velocidad. Dejar C = concentración de ADN monocatenario en el momento\(t\) (expresado como moles de nucleótidos por litro). La tasa de pérdida de ADN monocatenario (ss) durante la renaturalización viene dada por la siguiente expresión para un proceso de tasa de segundo orden:
\[ \dfrac{-dC}{dt}= kC^2 \]
o
\[\dfrac{dC}{C^2}=-kdt \]
La integración y alguna sustitución algebraica muestra que
\[ \dfrac{C}{C_o}=\dfrac{1}{1+kC_ot} \;\;\; \label{1}\]
Así, a la mitad de la renaturalización, cuando
\[\dfrac{C}{C_o}=0.5 \; \text{at} \; t=t_{1/2} \]
se obtiene:
\[ C_ot_{1/2}=\dfrac{1}{k} \; \;\; \label{2}\]
donde\(k\) es la constante de velocidad en litros (mol nt) -1 seg -1
La constante de velocidad para la renaturalización es inversamente proporcional a la complejidad de la secuencia.
La constante de velocidad, k, muestra la siguiente proporcionalidad:
\[ k \propto \dfrac{\sqrt{L}}{N} \;\;\; \label{3} \]
donde
- L = longitud y
- N = complejidad.
Empíricamente, la constante de velocidad k se ha medido como
\[ k = 3x10^5 \dfrac{\sqrt{L}}{N}\]
en 1.0 M Na + en\(T = T_m - 25^oC \)
El tiempo requerido para la mitad de la renaturalización (y por lo tanto C o t 1/2) es directamente proporcional a la complejidad de la secuencia.
De Ecuaciones\ ref {2} y\ ref {3},
\[C _0 t_{1/2} \propto \dfrac{N}{\sqrt{L}} \;\;\;\; \label{4}\]
Para una medición de renaturalización, generalmente se cizalla el ADN a una longitud constante de fragmento L (por ejemplo, 400 pb). Entonces L ya no es una variable, y
\[ C_o t_{1/2}\propto N \;\;\;\; \label{5}.\]
Los datos para la renaturalización del ADN genómico se representan como\(C_0 t\) curvas:
La renaturalización de un solo componente es completa (0.1 a 0.9) sobre 2 logs de\(C_0t\) (e.g., 1 a 100 para el ADN de E. coli), según lo predicho por la Ecuación\ ref {1}.
La complejidad de la secuencia generalmente se mide por una proporcionalidad a un estándar conocido
Si tiene un estándar de tamaño de genoma conocido, puede calcular\(N\) a partir de\(C_0t_{1/2}\):
\[ \dfrac{N^{unknown}}{N^{known}} = \dfrac{C_0t_{1/2}^{unknown}}{C_0t_{1/2}^{known}} \;\;\;\; (6)\]
Un estándar conocido podría ser
- E. coli con N = 4.639 x 10 6 pb
- pBR322 con N = 4362 pb
Las secuencias de ADN más complejas renaturalizan más lentamente que las secuencias menos complejas. Al medir la tasa de renaturalización para cada componente de un genoma, junto con la tasa para un estándar conocido, se puede medir la complejidad de cada componente.