4.2: Análisis de curvas de renaturalización con múltiples componentes
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En esta sección, el análisis de la Sección 4.2 se aplica cuantitativamente en un ejemplo de renaturalización del ADN genómico. Si un ADN desconocido tiene un solo componente cinético, lo que significa que la fracción renaturalizada aumenta de 0.1 a 0.9 a medida que el valor de C 0 t aumenta 100 veces, entonces se puede calcular su complejidad fácilmente. Usando la ecuación (6), todo lo que uno necesita saber es su C 0 t 1/2, más la\(C_0t_{1/2}\) y complejidad de un estándar renaturalizado en idénticas condiciones (concentración inicial de ADN, concentración de sal, temperatura, etc.).
La misma lógica se aplica al análisis de un genoma con múltiples componentes cinéticos. Algunos genomas vuelven a aparearse en un rango de valores de C 0 t que cubren muchos órdenes de magnitud, por ejemplo, de 10 -3 a 10 4. Algunas de las renaturalizaciones del ADN son muy rápidas; tiene baja complejidad, y como veremos, alta frecuencia de repetición. Otros componentes en la renaturalización del ADN lentamente; estos tienen mayor complejidad y menor frecuencia de repetición. La única nueva arruga para el análisis, sin embargo, es tratar cada componente cinético de forma independiente. Este es un enfoque razonable, ya que el ADN se corta a fragmentos cortos, por ejemplo, 400 pb, y es poco probable que un ADN de renaturalización rápida sea parte del mismo fragmento que un ADN renaturalizante lento.
Algunos términos y abreviaturas necesitan definirse aquí.
- f = fracción del genoma ocupada por un componente
- \(C_0t_{1/2}\)para el componente puro = (f) (\(C_0t_{1/2}\)medido en la mezcla de componentes)
- R = frecuencia de repetición
- G = tamaño del genoma. G puede medirse químicamente (por ejemplo, cantidad de ADN por núcleo de una célula) o cinéticamente (ver más abajo).
Se puede leer e interpretar la\(C_0t\) curva de la siguiente manera. Se tiene que estimar el número de componentes en la mezcla que conforma el genoma. En el ejemplo hipotético de la Figura 4.5, se pueden observar tres componentes, y otro se infiere porque el 10% del genoma se ha renaturalizado tan rápidamente como se puede hacer el primer ensayo. Los tres componentes observables son los tres segmentos de la curva, cada uno con un punto de inflexión en el centro de una parte de la curva que cubre un aumento de 100 veces en\(C_0t\) (a veces llamado 2 logs de\(C_0t). The fraction of the genome occupied by a component, f, is measured as the fraction of the genome annealing in that component. The measured\(C_0t_{1/2}\) es el valor\(C_0t\) al que se ha renaturalizado la mitad del componente. En la Figura 4.5, las renaturalizaciones del componente 2 entre\(C_0t\) los valores de 10 -3 y 10 -1, y la fracción del genoma renaturalizado aumentaron de 0.1 a 0.3 en este rango. Así f es 0.3-0.1=0.2. El valor C 0 t a la mitad de la renaturalización para este componente es el valor visto cuando la fracción renaturalizada alcanzó 0.2 (es decir, a mitad de camino entre 0.1 y 0.3; este valor C 0 t es 10 -2, y se le conoce como C 0 t 1/2 para el componente 2 (medido en la mezcla de componentes). Los valores para los demás componentes se tabulan en la Figura 4.5.
Todos los componentes del genoma están presentes en el ADN genómico inicialmente desnaturalizado. Así, el valor para C 0 es para todo el ADN genómico, no para los componentes individuales. Pero una vez que se conoce la fracción del genoma ocupada por un componente, se puede calcular el C 0 para cada componente individual, simplemente como C 0 'f. Así el\(C_0t_{1/2}\) para el componente individual es el\(C_0t_{1/2}\) (medido en la mezcla de componentes) 'f. Por ejemplo el\(C_0t_{1/2}\) para el componente individual (puro) 2 es 10 -2 '0.2 = 2' 10 -3.
Conociendo lo medido\(C_0t_{1/2}\) para un estándar de ADN, se puede calcular la complejidad de cada componente.
\[ Nn= C_0t_{1/2}_{pure}, n \]'
- donde n se refiere al componente particular, es decir (1, 2, 3 o 4)
La frecuencia de repetición de un componente dado es el número total de pares de bases en ese componente dividido por la complejidad del componente. El número total de pares de bases en ese componente viene dado por fn 'G.
Rn =
Para los datos de la Figura 4.5, se pueden calcular los siguientes valores:
| Componente | f | \(C_0t_{1/2}\), mezclar | \(C_0t_{1/2}\), puro | N (pb) | RR |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 plegamiento | 0.1 | \ (C_0t_ {1/2}\), mezcla” style="vertical-align:middle; ">< 10 -4 | \ (C_0t_ {1/2}\), puro” style="vertical-align:middle; ">< 10 -4 | ||
| 2 rápido | 0.2 | \ (C_0t_ {1/2}\), mezcla” style="vertical-align:middle; ">10 -2 | \ (C_0t_ {1/2}\), puro” style="vertical-align:middle; ">2 x 10 -3 | 600 | 10 5 |
| 3 intermedio | 0.1 | \ (C_0t_ {1/2}\), mezcla” style="vertical-align:middle; ">1 | \ (C_0t_ {1/2}\), puro” style="vertical-align:middle; ">0.1 | 3 x 10 4 | 10 3 |
| 4 lento (copia única) | 0.6 | \ (C_0t_ {1/2}\), mezcla” style="vertical-align:middle; ">103 | \ (C_0t_ {1/2}\), puro” style="vertical-align:middle; ">600 | 1.8 x 10 8 | 1 |
| ADN bacteriano std | \ (C_0t_ {1/2}\), mezcla” style="vertical-align:middle;” class="lt-bio-10000"> | \ (C_0t_ {1/2}\), puro” style="vertical-align:middle; ">10 | 3 x 10 6 | 1 |
El tamaño del genoma, G, se puede calcular a partir de la relación entre la complejidad y la frecuencia de repetición.
G =
Por ejemplo, si G = 3 x 108 pb, y el componente 2 ocupa 0.2 de él, entonces el componente 2 contiene 6 x 107 pb. Pero la complejidad del componente 2 es de sólo 600 pb. Por lo tanto, se necesitarían 105 copias de esa secuencia de 600 pb para comprender 6 x 10 7 pb, y suponemos que R = 105.
Ejercicio 4.1
Si se sustituye la ecuación por N n y por G en la ecuación por Rn, se puede derivar una relación simple para R en términos de\(C_0t_{1/2}\) valores medidos para la mezcla de componentes. ¿Qué es?
Tipos de ADN en cada componente cinético para genomas complejos
Los genomas eucariotas suelen tener múltiples componentes, lo que genera curvas complejas de C0 t. La Figura 4.6 muestra una curva C0t esquemática que ilustra los diferentes componentes cinéticos del ADN humano, y en la siguiente tabla se dan algunos ejemplos de miembros de los diferentes componentes.
| Cinética de renaturalización | C 0 t descriptor | Frecuencia de repetición | Ejemplos |
|---|---|---|---|
| demasiado rápido para medir | “Foldback” | no aplica | repeticiones invertidas |
| renaturalización rápida | bajo C 0 t | muy repetida, > 10 5 copias por celda | repeticiones cortas intercaladas (por ejemplo, repeticiones Alu humanas); repeticiones en tándem de secuencias cortas (centrómeros) |
| renaturalización intermedia | medio C 0 t | moderadamente repetido, 10-10 4 copias por celda | familias de repeticiones intercaladas (por ejemplo, repeticiones largas L1 humanas); ARNr, ARN 5S, genes de histonas |
| renaturalización lenta | alto C 0 t | bajo, 1-2 copias por celda, “copia única” | la mayoría de los genes estructurales (con sus intrones); gran parte del ADN intergénico |
N, R para ADN repetidos son promedios para muchas familias de repeticiones. Los miembros individuales de familias de repeticiones son similares pero no idénticos entre sí.
La imagen emergente del genoma humano revela aproximadamente 30,000 genes que codifican proteínas y ARN estructurales o funcionales. Estos se distribuyen en 22 autosomas y 2 cromosomas sexuales. Casi todos tienen intrones, algunos con algunos intrones cortos y otros con muchos intrones largos. Casi siempre una cantidad sustancial de ADN intergénico separa los genes.
Varias familias diferentes de ADN repetitivo se intercalan a lo largo de las secuencias intergénicas e intrónicas. Casi todas estas repeticiones son vestigios de eventos de transposición, y en algunos casos se han encontrado los genes fuente para estos transposones. Algunas de las familias más abundantes de repeticiones transpuestas a través de un ARN intermedio, y pueden denominarse retrotransposones. La familia repetitiva más abundante en humanos son las repeticiones Alu, llamadas así por un sitio de endonucleasa de restricción común dentro de ellas. Tienen alrededor de 300 pb de largo, y alrededor de 1 millón de copias están en el genoma. Probablemente se derivan de un gen modificado para un ARN pequeño llamado ARN 7SL. (Este ARN está involucrado en la traducción de proteínas secretadas y unidas a membrana). Los genomas de especies de otros órdenes de mamíferos (y de hecho todos los vertebrados examinados) tienen números aproximadamente comparables de repeticiones cortas intercaladas derivadas independientemente de genes que codifican otros ARN cortos, tales como ARN de transferencia.
Otra clase prominente de retrotransposones repetitivos son las repeticiones largas de L1. Las copias de longitud completa de las repeticiones L1 tienen una longitud de aproximadamente 7000 pb, aunque muchas copias están truncadas desde el extremo 5'. Alrededor de 50 mil ejemplares están en el genoma humano. Las copias completas de los genes L1s recientemente transpuestos y sus fuentes tienen dos marcos de lectura abiertos (es decir, pueden codificar dos proteínas). Una es una proteína multifuncional similar al gen pol de los retrovirus. Cofica una transcriptasa inversa funcional. Esta enzima puede desempeñar un papel clave en la transposición de todos los retrotransposones. Las repeticiones similares a las L1s se encuentran en todos los mamíferos y en otras especies, aunque las L1s dentro de cada orden de mamíferos tienen características distintivas a ese orden. Así, tanto las repeticiones cortas intercaladas (o SINE) como las repeticiones intercaladas largas L1 (o LINES) se han expandido y propugnado independientemente en diferentes órdenes de mamíferos.
Ambos tipos de retrotransposones están actualmente activos, generando mutaciones de novo en humanos. Un pequeño subconjunto de SINE se ha implicado como elementos funcionales del genoma, proporcionando señales de procesamiento postranscripcional, así como exones codificantes de proteínas para un pequeño número de genes.
Otras clases de repeticiones, como L2s (repeticiones largas) y MIRS (repeticiones cortas llamadas repeticiones intercaladas de mamíferos), parecen ser anteriores a la radiación de los mamíferos, es decir, parecen haber estado en el mamífero euterio ancestral. Otras clases de repeticiones son elementos transponibles que se mueven por un intermedio de ADN.
Otras secuencias repetidas intercaladas comunes en humanos