4.3: Abundancia de ARN

La disponibilidad de sondas de ADN clonadas para muchos genes ha facilitado enormemente el análisis de cantidades de ARN en diferentes células o bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, es muy común marcar una sonda de ADN que hibridará con ARNm; el ADN proviene de un clon de ADNc o de un clon genómico que contiene un exón. La sonda marcada se hibrida luego con ARN total o que contiene poliA (este último se llama ARN poliA+, y es aproximadamente equivalente al ARNm) de una célula. La concentración de la sonda es mucho mayor que la concentración del ARNm diana para el gen específico, por lo que la sonda está en un gran exceso y todo el ARNm del gen de interés debe ser conducido a un dúplex con la sonda. La cantidad de sonda protegida de la digestión por una nucleasa específica monocatenaria tal como la nucleasa S1 da una medida de la cantidad del ARNm específico que está en la célula. (Esta situación difiere en algunos aspectos importantes del material en la estimación de números de genes expresados y abundancia de la cinética de reacciones impulsadas por ARN. En ese material, uno estaba mirando poblaciones enteras de ARNm, mientras que en esta situación, uno está mirando solo un ARNm, el complementario a la sonda marcada).

[Dos notas técnicas: El ensayo diagnóstico aquí mide la cantidad de ADN marcado en dúplex y el ADN no hibridado se digiere. Si la sonda de ADN es originalmente bicatenaria, inicialmente se desnaturaliza antes de la hibridación, pero ahora ¿cómo se distingue entre la protección de nucleasas que surge de dúplex de ADN-ARNm versus las que surgen de las dos cadenas de rehibridación de ADN? El enfoque más limpio es simplemente sintetizar y marcar la cadena de ADN complementaria al ARNm; esto se puede hacer mediante elecciones apropiadas de cebadores para la síntesis de ADN a partir de plásmidos que portan el ADN utilizado como sonda. Alternativamente, se puede preparar una sonda de ADN dúplex marcada que se extiende más allá de la porción codificante de ARNm de un gen, de modo que el dúplex ADN-ADN resultante de la rehibridación es mayor que el dúplex ADN-ARN resultante de la hibridación con ARNm. Además, se utilizan condiciones de hibridación con altas concentraciones de sal y formamida que favorecen los dúplex ADN-ARN sobre los dúplex ADN-ADN. (2) Un enfoque equivalente es sintetizar una sonda de ARN derivada del ADN clonado; este “ARN complementario” forma un dúplex más fuerte con el ARNm que el ADNc; ARN-ARN Los dúplex son más fuertes que los dúplex de ARN-ADN en condiciones de altas concentraciones de sal y formamida. Luego se detectan los fragmentos protegidos de la digestión por las RNasas.]

a) Las células de eritroleucemia murina (MEL) son equivalentes a los proeritroblastos, inmortalizadas por el complejo del virus Friend para que puedan crecer continuamente en cultivo. El tratamiento con pequeños compuestos orgánicos como el dimetilsulfóxido (DMSO) los inducirá a madurar en eritroblastos, con un aumento sustancial en la expresión de genes específicos eritroides (el mecanismo para esta inducción aún se desconoce). Digamos que aisló el ARN total tanto de células no inducidas (no tratadas) como de un número igual de células inducidas por DMSO. Las muestras de ARN se hibridaron con un exceso de una sonda de ADN radiomarcada de un gen de b-globina de ratón, y se determinó la cantidad de sonda hibridada al ARNm mediante tratamiento de las muestras con nucleasa S1, electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante, y midiendo la cantidad de radiactividad en el resultante del dúplex de ARNm-ADN. A continuación se muestra una ilustración del heterodúplex, el tratamiento con nucleasa S1 y la autorradiografía resultante del gel. El fragmento protegido de células no inducidas tuvo 10,000 cpm y el fragmento protegido de células inducidas tuvo 500,000 cpm. Un control negativo con ARN de una línea celular linfocítica T, que no produce ARNm de globina, no dio protección, es decir, 0 cpm para el fragmento diagnóstico. La expresión de este gen de la b-globina se induce ¿cuánto en las células MEL tratadas con DMSO?

b) El ensayo anterior da las cantidades relativas del ARNm en las dos condiciones, y este es un ensayo extremadamente potente y ampliamente utilizado. Pero, ¿qué significa esto en términos de moléculas de ARNm por célula, es decir, cómo cambia la abundancia al momento de la inducción? Se puede alterar un poco este ensayo para obtener una medida de abundancia, similar en principio a los cálculos de la Sección VIIF. Primero, se necesita una medida del número de moléculas de ARNm por célula. Digamos que cosechó 107 células MEL y aisló 3 mg de ARN poliA+ (esencialmente ARNm). ¿Cuál es el número total de moléculas de ARNm por célula MEL, suponiendo una longitud promedio de ARNm de 2000 nucleótidos?

c) Si se marca el ARN en las células MEL, por ejemplo, cultivando las células en presencia de [3H] uridina, que se incorpora solo al ARN, entonces el ARN poliA+ aislado y marcado puede hibridarse con un exceso del ADN (ahora no marcado) complementario al ARNm de interés. El ARN en dúplex con ADN puede detectarse por su protección contra la digestión por nucleasas como RNasa A y RNasa T1; la autorradiografía resultante se vería algo así como la que se muestra a continuación, con bandas que contienen más radiactividad representadas como un relleno más oscuro. Dado que el ADN todavía está en exceso, todo el ARNm complementario a la sonda debe ser conducido a dúplex, y se puede medir fácilmente la fracción de ARN poliA+ complementario a cada sonda. La siguiente tabla proporciona algunos datos representativos e idealizados para el ARN poliA+ de células MEL inducidas e inducidas, incluyendo el ARN de entrada total (no tratado con nucleasas) y la cantidad protegida de la digestión con nucleasas por hibridación con un exceso de ADN del gen de la b-globina, ADN que codifica el eritroide factor de transcripción GATA1, y ADN que codifica ovoalbúmina (que no se expresa en células MEL, es decir, es un control negativo). ¿Qué fracción del ARNm (o ARN poliA+) está compuesta por ARNm de estos tres genes, y cuál es su abundancia en células no inducidas e inducidas?

Sonda de ADN	cpm células MEL no inducidas protegidas	cpm células MEL inducidas protegidas
[ARN marcado de entrada]	[1.000.000]	[1.000.000]
b-globina	5,000	250,000
GATA1	25	25
ovoalbúmina	0	0

d) En general, ¿cuál es la distribución de los ARNm en un tipo particular de célula diferenciada, es decir, qué tan abundantes son las diferentes clases de complejidad de ARNm?

Uso de bases de datos de secuencias, mutaciones y datos funcionales

4.6 Se utilizó la biosíntesis de arginina para ilustrar el análisis de complementación y la construcción de una vía. Los pasos involucrados en la síntesis de arginina también forman parte del ciclo de la urea. Una de las enzimas cataliza la formación de citrulina a partir de fosfato de carbamoil y ornitina. Averiguemos más sobre esta enzima, llamada ornitina transcarbamilasa, o OTC.

Usa tu navegador web favorito para ir a la URL del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica).

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Da click en el botón Entrez. Entrez proporciona un portal a muchos tipos de información en este servidor. Empecemos con secuencias de ADN y proteínas.
• Haga clic en el botón Nucleótidos.
• Ingresa “X00210" y presiona el botón Buscar. No ingrese las comillas, y esas son ceros y un uno, no O ni l.
• Deberías obtener un reporte sobre el gen para OTC en E. coli, llamado ArgI.

1. ¿Qué tan grande es la región codificante de proteínas, desde el codón de iniciación de la traducción hasta el codón de terminación ¿Qué tan grande es la proteína codificada?
2. ¿Dónde está el gen argI en el cromosoma E. coli? Regrese al servidor Entrez (donde hizo clic en Nucleotides antes). Haga clic en Genomas y, a continuación, seleccione Escherichia coli. Ingresa “ARGi” en la ventana Buscar (no ingrese las comillas, y esa es la letra I “ojo” no una “una”).

4.7 ¿La proteína OTC de E. coli está relacionada con alguna otra proteína en las bases de datos de secuencias? Necesitas obtener la secuencia proteica, lo cual puedes hacer haciendo clic en ArgI mientras estás en el mapa del genoma, o puedes volver a la entrada del gen (número de acceso X00210). Si estás en el GenBank Report para ingresar X00210, debes hacer clic en el botón Proteína en la parte superior de la página, y luego seleccionar Informe FaSta en la página siguiente. (Si toma la ruta predeterminada el Informe GenPept, eso está bien, también puede obtener el Informe FaSta a partir de ahí). Haga una copia de esta secuencia OTC en formato FaSta (es posible que desee guardarla en otro programa, por ejemplo, su procesador de textos favorito, para mayor comodidad).

Ahora haga clic en el botón Explosión en la parte superior de la página, y en la página siguiente seleccione Búsqueda Básica de Explosión. En el servidor Blast, seleccione blastp en el menú desplegable junto a Programa (esto alinea las secuencias de proteínas; la blastn predeterminada alinea las secuencias de nucleótidos) y pegue la secuencia OTCSequence de E. coli en formato FastA en la ventana de entrada. Tenga en cuenta que el menú desplegable le da la opción de ingresar el número de acceso (40962) en lugar de la secuencia. Las bases de datos de secuencia por defecto son nr, la compilación no redundante de bases de datos de Estados Unidos, Europa y Japón. Lo usaremos, pero tenga en cuenta que un menú desplegable le permite seleccionar otras bases de datos.

a) Haga clic en el botón Enviar consulta. Cuando finalmente se ejecuta el trabajo (esto puede tardar un minuto o más cuando el Servidor está ocupado) ¿qué ves?

b) ¿La proteína OTC de E. coli está relacionada con alguna proteína humana? Desplácese hacia abajo en la tabla de éxitos, más allá de muchos OTC bacterianos (Neisseria, Pyrococcus...) hasta que se encuentre con algunos golpes de mamíferos. Con una puntuación de 172, deberías encontrar un hipervínculo a SP|P00480|OTC_HUMAN ORNITINA CARBAMOILTRANSFERASE PRESURENTE. Haga clic en este hipervínculo.

4.8 La entrada para OTC humana (P00480, que es la misma que 400687) es bastante larga.

a) ¿Qué ocupa gran parte de la tabla de características? ¿Qué te dice esto sobre el gen OTC en humanos?

b) Usando ya sea la tabla de características para la entrada GenBank 400687 (o P00480) o mejor aún, regrese a la página principal del NCBI y haga clic en el botón OMIM para ir al On-Line Medelian Inheritance In Man (de Victor McKusick, M.D.). ¿Dónde está el gen? ¿Qué sucede en la deficiencia de OTC?

4.9 ¿Qué te dicen las secuencias de aminoácidos alineadas de las proteínas bacterianas y humanas? ¿Las regiones conservadas se correlacionan con las regiones funcionales? Por ejemplo, ¿la mutación de algún aminoácido en las regiones conservadas conduce a un fenotipo en humanos?

Dado que la búsqueda Blast generó tantos aciertos con puntuaciones más altas que la pareja E. coli - humano, tendremos que usar una herramienta diferente para ver la alineación. En la página superior del servidor Blast (donde seleccionó la búsqueda Básica de Explosión antes), seleccione Secuencias de Blast 2. Esta utilidad le permite ingresar dos secuencias cualesquiera y generar una alineación por pares por el programa Blast2. Debe usar las secuencias de proteína OTC humana y E. coli o sus números de acceso, y asegúrese de elegir blastp como programa. Al hacer esto en julio de 1998, me encontré con un problema con la utilidad haciendo un duplicado de cada secuencia que ingresé (no sé si eso fue un problema de mi parte o de ellos); esto es probablemente una condición temporal. Si encuentra algún problema, pruebe con otro Servidor, como el Servidor de Análisis de Secuencia en genome.cs.mtu.edu/sas.html. Elija Alineación de Secuencias por Pares, ingrese sus secuencias y ejecute GAP o SIM en secuencias de proteínas.

Cromatina

4.10 Una de las evidencias tempranas importantes que ayudaron a definir la estructura del nucleosoma fue el patrón de escisión de nucleasas en la cromatina. En este experimento, la cromatina se trató brevemente con una enzima, nucleasa microcócica, que degrada el ADN, luego se retiró toda la proteína y el ADN purificado se resolvió por electroforesis. Se observó un patrón regular de bandas anchas; los tamaños promedio de los fragmentos de ADN fueron múltiplos de 200 pb, es decir, 200, 400, 600, 800 pb, etc. ¿Qué le dice este resultado sobre la estructura de la cromatina? Las bandas de las bandas de ADN eran gruesas y se extendían más que afiladas; ¿qué te dice esto sobre las posiciones de escisión por nucleasa microcócica?

4.11 ¿Qué histonas están en el núcleo del nucleosoma? ¿Cuáles son las interacciones proteína-proteína en el núcleo? ¿Qué dominios proteicos median estas interacciones?

4.12 El virus mamífero SV40 tiene minicromosomas en los que el ADN dúplex circular se empaqueta en nucleosomas. Cuando se eliminan las histonas de los minicromosomas, se encuentra que el ADN resultante está superenrollado negativamente. ¿Qué te dice esto sobre el estado del ADN en los minicrosomas y el camino del ADN alrededor del nucleosoma?

4.13 ¿Son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones?

1. El ADN se enrolla alrededor de las histonas alrededor de 1.65 vueltas por núcleo nucleosómico.
2. El ADN en la cromatina que contiene genes transcritos activamente suele ser más sensible a las ADNasas que el ADN en la cromatina no transcrita.

4.14 La relación de empaquetamiento de un complejo de ácido nucleico-proteína es la relación entre la longitud del ADN desnudo en forma B normal y la longitud de la estructura proteína-ADN. Por ejemplo, si un conjunto de proteínas plegó una molécula de ADN de 100 Å en una estructura de 25 Å de largo, esta estructura tiene una relación de empaquetamiento de 4.

a) Dadas las dimensiones de la estructura del nucleosoma, ¿cuál es la relación de empaquetamiento para el ADN en el núcleo del nucleosoma? Tenga en cuenta que el tono es la distancia entre los puntos medios del dúplex de ADN a medida que gira alrededor de las histonas en el núcleo.

b) Si los nucleosomas están apretados en un solenoide con 6 nucleosomas por giro, ¿cuál es la relación de empaque ahora? Supongamos que cada giro del solenoide se traduce 110 Å, es decir, la distancia entre los puntos medios de los nucleosomas en vueltas sucesivas del solenoide es de 110 Å.

4.15 ¿Qué tan cerca están los bordes del ADN a medida que se curva alrededor de la superficie del núcleo nucleosómico?

Colaboradores y Atribuciones

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