Proteínas de replicación eucariota
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Las uniones molde-cebador son reconocidas por el factor de replicación multisubunidad C, o RFC. Al igual que el complejo g en E. coli, esta enzima es una ATPasa, y ayuda a cargar sobre el factor de procesividad PCNA. Así RFC está llevando a cabo una función similar al complejo g bacteriano.
Una de las primeras polimerasas eucariotas que se aislaron fue la ADN polimerasa a, que ahora se reconoce como un catalizador de la síntesis de cebadores. Esta enzima contiene cuatro subunidades polipeptídicas, una con actividad polimerasa (170 kDa), dos que comprenden una actividad primasa (50 y 60 kDa), y otra subunidad de función (actualmente) indeterminada (70 kDa). La ADN polimerasa a tiene baja procesividad pero alta fidelidad. Esta alta fidelidad es sorprendente porque no se asocia ninguna exonucleasa 3' a 5' con la enzima. La polimerasa a, posiblemente con primasas adicionales, cataliza la síntesis de segmentos cortos de ADN y ARN que sirven como cebadores para las polimerasas replicativas.
La ADN polimerasa e está relacionada con la polimerasa d, y puede desempeñar un papel en la síntesis de cadenas rezagadas. También depende de PCNA, in vivo. Sin embargo, no se ha identificado ningún requerimiento para ello en sistemas de replicación viral in vitro.
El compuesto afidicolina bloqueará el crecimiento de células de mamíferos. Lo hace impidiendo la replicación del ADN, y las dianas de este fármaco son las ADN polimerasas a y d (así como e). El hecho de que la inhibición de estas ADN polimerasas con afidicolina también detenga la replicación del ADN en células de mamíferos argumenta que de hecho, a y d son responsables de la replicación del ADN nuclear en células eucariotas. Esta conclusión está fuertemente respaldada por el fenotipo de mutaciones condicionales de pérdida de función en los genes que codifican los homólogos de estas polimerasas en levaduras. Dichos mutantes no crecen a la temperatura restrictiva, lo que indica que d y a son las polimerasas replicativas. La evidencia bioquímica implica a la polimerasa a en la formación de cebadores, y d parece ser las principales polimerasas utilizadas para sintetizar las nuevas cadenas de ADN.
| Función | Bacteriano (E. coli) | Número de subunidades | Replicación eucariota (SV40) | Número de subunidades |
|---|---|---|---|---|
| Síntesis de hebras líderes y rezagadas | dímero asimétrico, polimerasa de E. coli III | 10 (3 en núcleo) | polimerasa d | 2 |
| Pinza deslizante | subunidad b | 2 | PCNA | 3 |
| Cargador de abrazaderas | complejo g | 6 | RFC | múltiples |
| Primase | DnAG | 1 | Polimerasa a | 4 |
| Helicasa | DNab | 6 | Antígeno T (SV40) | 6 |
| Unir ADN monocatenario | SSB | 1 | RFA | 3 |
| Giratorio | Gyrase | 4, A 2 B 2 | Topo I o Topo II | 1 2 (homodímero) |
Los paralelismos entre la replicación del ADN bacteriano y eucariota son sorprendentes. La estrategia general de síntesis es similar, y las proteínas análogas llevan a cabo funciones similares, como se indica en la Tabla 5.4. Es difícil determinar si las proteínas que llevan a cabo funciones similares son en realidad proteínas homólogas, es decir, codificadas por genes descendientes del mismo gen en el último ancestro común. Las identidades de secuencia de proteínas son marginales, y frecuentemente las proteínas análogas tienen diferentes números de subunidades. Estas diferencias complican considerablemente el análisis, ya que diferentes subunidades en bacterias o mamíferos pueden tener funciones similares. Sin embargo, las similitudes funcionales son convincentes.
Varias otras ADN polimerasas han sido aisladas de células eucariotas. Las ADN polimerasa b y e están involucradas en la reparación del ADN nuclear. La ADN polimerasa b es un único polipéptido de 36 kDa, y no tiene exonucleasa de 3' a 5'. La ADN polimerasa g replica el ADN mitocondrial.
La transcriptasa inversa se conoce frecuentemente como una ADN polimerasa dependiente de ARN porque puede usar ARN como molde, pero de hecho puede usar ARN o ADN como molde. Está codificado por retrovirus, y por lo tanto está presente en células infectadas con un retrovirus. Esta enzima tiene un uso generalizado en el laboratorio para hacer copias complementarias de ARN, llamadas ADNc. Las copias activas de elementos repetitivos LINE1 (en mamíferos) o repeticiones Ty1 (en levaduras), también codifican transcriptasa inversa. Así, en las células donde se transcriben estos elementos retrotransponibles, también está presente la transcriptasa inversa activa. La transcriptasa inversa también tiene una actividad de RNasa H, que digiere el ARN de un dúplex de ARN-ADN.
A diferencia de las otras ADN polimerasas discutidas en este capítulo, la desoxinucleotidil-transferasa terminal no requiere un molde. Agrega dNTPs (como dNMP) al extremo 3' del ADN, usando ese hidroxilo 3' como cebador. Se encuentra en la diferenciación de linfocitos, y parece ser utilizada fisiológicamente para introducir mutaciones somáticas en genes de inmunoglobulina. En el laboratorio, se utiliza para agregar “colas de homopolímero” a los extremos de las moléculas de ADN incubando un ADN lineal con un dNTP particular y desoxinucleotidil-transferasa terminal.
Como se discutirá con más detalle en el próximo capítulo, los extremos de los cromosomas lineales (telómeros) deben expandirse en cada replicación o eventualmente se acortarán. La enzima telomerasa cataliza la adición de muchas copias en tándem de una secuencia simple a los extremos de los cromosomas. El molde para esta reacción es un ARN que es un componente de la enzima. Así, la telomerasa es una transcriptasa inversa que solo realiza copias del molde que lleva, utilizando como cebador el extremo 3' de una cadena de ADN cromosómico.