11.E: Transcripción: Promotores, terminadores y ARNm (Ejercicios)

Q11.1 Determinar las secuencias que codifican los extremos de los ARNm

Un gen que determina el color de ojos en salamandras, llamado almendra, está contenido dentro de un fragmento Kpn I de 2000 pb. Después de clonar el fragmento Kpn I en un plásmido, se descubrió que tiene un sitio Bgl II a 500 pb del sitio Kpn I izquierdo y un sitio EcoRI a 300 pb del sitio Kpn I derecho, como se muestra en el siguiente mapa.

bp 0 500 1000 1500 2000

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Kpn I Bgl II Eco RI Kpn I

Para determinar las posiciones que corresponden a los extremos 5' y 3' del ARN de almendra, se marcaron los sitios Eco RI y Bgl II en el extremo 5' o 3'. Se aislaron los fragmentos Kpn I a Bgl II (500 y 1500 pb) y los fragmentos Kpn I a Eco RI (1700 y 300 pb), se hibridaron con ARN de almendra y se trataron con la nucleasa específica monocatenaria S1. Los tamaños de los fragmentos de sonda protegidos de la digestión en el dúplex ARN‑ADN se muestran a continuación (en nucleótidos); a 0 significa que la sonda no estaba protegida por ARN.

Sonda marcada con extremo 5' sonda marcada en el extremo 3'

protegido protegido

fragmento de sonda fragmento de sonda

Kpn I‑ Bgl II* 5000 Kpn I‑ Bgl II* 500 100

* Bgl II‑ Kpn I 1500 1300 * Bgl II‑ Kpn I 1500 0

Kpn I‑ Eco RI* 17000 Kpn I‑ Eco RI* 1700 1300

* Eco RI‑ Kpn I 300 100 * Eco RI‑ Kpn I 300 0

El asterisco denota el extremo que se etiquetó.

1. ¿Cuál es la dirección de transcripción del gen almendra, relativo al mapa anterior?
2. ¿Qué posición en el mapa corresponde al extremo 5' del ARNm?
3. ¿Qué posición en el mapa corresponde al extremo 3' del ARNm?

Q11.2: Determinación de las secuencias que codifican los extremos de los ARNm

El gen para la histona H2A del armadillo puede aislarse como un fragmento Pst I de 1400 pb. El mapa se muestra a continuación; el fragmento de armadillo Pst I se muestra por la línea discontinua doble, y el ADN del vector se denota por las líneas discontinuas simples. Los tamaños están en pares de bases. El clon del gen H2A se escindió con Hind III, se trató con fosfatasa alcalina y se incubó con polinucleótido quinasa y [32P] ATP en un tampón apropiado para introducir un radiomarcador en los extremos 5' de los fragmentos de ADN. Luego se extrajo el ADN con fenol para eliminar la quinasa, y luego se volvió a cortar con Pst I. Los fragmentos marcados de 600 pb y 800 pb Pst I-Hind III se separaron por electroforesis en gel y se aislaron. Los fragmentos aislados fueron desnaturalizados, hibridados a ARNm de histona y tratados con nucleasa S1. Los fragmentos de ADN marcados resistentes a S1 se identificaron mediante electroforesis en gel seguida de radioautografía. Se observó un fragmento protegido de 200 nucleótidos cuando se utilizó el fragmento de 600 pb en el ensayo de protección S1, pero no se observó ningún fragmento protegido cuando se utilizó el fragmento de 800 pb.

|—600—|—800—|

Pst I Hind III Pst I

—|===============================================|—

| | |

0 500 1000 1400

1. ¿Cuál es la dirección de transcripción del gen de la histona H2A (relativo al mapa de restricción anterior)?
2. Con referencia a los números debajo del mapa de restricción, ¿cuál es la posición del extremo 5' del ARNm de la histona H2A?
3. ¿Cuál es la posición del extremo 3' del ARNm?

Q11.3

Se investigó un fragmento de ADN de 400 pb que contenía el sitio de inicio para la transcripción del gen almendra para encontrar señales de control transcripcional. El sitio de inicio (+1 en el sistema de coordenadas) está a 100 pb desde el extremo derecho. El fragmento de 400 pb es suficiente para conducir la transcripción de un gen informador (para luciferasa) en una línea celular apropiada. Se realizaron dos series de deleciones 5' y 3' en el fragmento de 400 pb y se analizó su capacidad para conducir la transcripción del gen informador de luciferasa. Cada fragmento de la serie de deleciones 5' tiene un extremo 5' diferente, pero todos están fusionados con el gen de luciferasa a +100 (ver diagrama a continuación). Cada fragmento de la serie de deleciones 3' tiene un extremo 5' común en ‑300, pero cada uno se fusiona con el gen de luciferasa en la posición 3' designada. La cantidad de luciferasa (una medida del nivel de transcripción) para cada constructo se muestra en los dos primeros pares de columnas de la tabla. El constructo indicador intacto, con ADN de almendra (la línea horizontal) fusionado al gen de luciferasa, se esquematiza inmediatamente a continuación.

‑300‑250 ‑200‑150 ‑100‑50 +1+50 +100

| | | | | | | |

________________________________________________|Luciferasa>

|

inicio>

Para investigar más a fondo la función de diferentes regiones, se agregaron subfragmentos del fragmento de ADN de almendra a un constructo en el que el gen informador fue impulsado por un promotor diferente, como se esquematiza a continuación. Los efectos de los fragmentos de ADN de almendra sobre este promotor heterólogo se muestran en el tercer par de columnas de la tabla.

Fragmento de ensayo del promotor heterólogo de ADN de almendra Gen Luciferas

___________________________| ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑

____________________ _____________________ _______________________

Puntos finales de deleción 5'	Cantidad de expresión	extremos de deleción 3'	Cantidad de expresión		Fragmento de prueba de almendra	Cantidad de expresión
‑300	100	‑200	0		‑300 a ‑250	100
‑250	100	‑150	0		‑250 a ‑200	500
‑200	50	‑100	0		‑200 a ‑150	100
‑150	50	‑50	0		‑150 a ‑100	300
‑100	25	+1	100		‑100 a ‑50	300
‑50	10	+50	100		‑50 a ‑1	100
‑1	0	+100	100		ninguno	100

1. ¿Cuál concluye que es el papel del fragmento ‑250 a ‑200?
2. ¿Cuál concluye que es el papel del fragmento ‑200 a ‑150?
3. ¿Cuál concluye que es el papel del fragmento ‑150 a ‑100?
4. ¿Cuál es el papel del fragmento ‑50 a ‑1 del gen de la almendra?

Q11.4

Se utilizó un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para probar la capacidad de un fragmento de restricción corto para unirse a proteínas de los núcleos de las células renales. El fragmento de restricción se etiquetó en un extremo, se mezcló con un extracto que contenía las proteínas nucleares y se ejecutó en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. El carril 1 (abajo) muestra la sonda libre y el carril 2 muestra la sonda más el extracto; la electroforesis es de arriba a abajo. Los complejos entre las proteínas y la sonda de ADN marcada se mueven más lentamente sobre el gel que la sonda libre. Se muestran pruebas adicionales de especificidad en los carriles de competencia, en los que la sonda marcada se mezcló con un exceso creciente de otro ADN antes de mezclarla con las proteínas nucleares para probar la unión. Los ADN competidores incluyeron la sonda no marcada (autocompetencia, carriles 3-5; el triángulo por encima de los carriles indica que se usa una cantidad creciente de competidor en carriles sucesivos), un ADN completamente diferente (ADN de E. coli cortado) como competidor inespecífico (carriles 6-8), y dos dúplex diferentes , uno que contiene el sitio de unión para Sp1 (carriles 9-11) y el otro que contiene el sitio de unión para Oct1 (carriles 12-14). Las cajas más delgadas y menos densamente rellenas denotan bandas de menor intensidad que las bandas más oscuras y gruesas.

1. ¿Cuántos complejos proteína-ADN se forman entre la sonda de ADN marcada y el extracto nuclear?
2. ¿Qué le dicen los carriles 3-8 sobre los complejos proteína-ADN?
3. ¿Qué le dicen los carriles 9-14 sobre los complejos proteína-ADN?

Q11.5

Para determinar los puntos de contacto entre una proteína reguladora y su sitio de unión en el ADN, se marcó el extremo de un pequeño fragmento de ADN dúplex (en el extremo 5' del extremo izquierdo como se escribe a continuación) y se trató con sulfato de dimetilo de manera que cada molécula en promedio tenga un nucleótido G metilado. La proteína reguladora se mezcló con la preparación de ADN parcialmente metilado, y el ADN unido a proteína se separó del ADN no unido. Después de escindir el ADN en los sitios metilados, los fragmentos resultantes se resolvieron en un “gel de secuenciación”. Un autorradiograma de los resultados mostró bandas correspondientes a todas las G en el fragmento marcado para el ADN no unido, pero el ADN unido a proteína no tenía bandas correspondientes a las G en las posiciones 14 y 16 siguientes. Cuando el extremo izquierdo del fragmento se marcó en el extremo 3', no se observó ninguna banda correspondiente a la G (cadena inferior) en la posición 18 (mismo sistema de numeración que para la cadena superior) en la preparación del ADN unido a proteínas.

5 10 15 20 25 30

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5' GATCCGCATGGATGAGTCACGTAACGTGTA

3' GCGTACCTACTCAGTGCATTGCACAT

¿Cuál es el sitio de unión para la proteína reguladora?

Q11.6

¿Son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones sobre los efectos r y polares de algunas mutaciones en operones en E. coli?

1. Las mutaciones sin sentido (traducción terminadora) en el primer gen de un operón no pueden tener ningún efecto sobre la transcripción del gen posterior en el operón.
2. Las mutaciones en el gen para r (gen rho) pueden suprimir la polaridad.
3. La proteína hexamérica r se une al ARN libre de proteínas y se mueve a lo largo del ARN; cuando encuentra una ARN polimerasa estancada promueve la terminación de la transcripción.
4. La proteína r es una ATPasa dependiente de ARN.