12.4: Autoempalme por intrones del grupo I (pre-ARNr de Tetrahymena)
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Se estableció una reacción in vitro para examinar la eliminación de un intrón del precursor al ARNr en Tetrahymena. Sorprendente, ¡se descubrió que el empalme del pre-ARN ocurrió en ausencia de cualquier proteína añadida!
Investigaciones posteriores revelaron que la reacción requiere un nucleótido o nucleósido de guanina con un 3'‑OH, más cationes mono- y divalentes. GTP, GDP, GMP o guanosina trabajarán para iniciar el empalme. No hay ningún requisito para la escisión de proteínas o enlaces de alta energía
El autoempalme se produce mediante un mecanismo de transferencia de fosfoéster (Figura 3.3.11)
El 3'‑OH del nucleótido guanina es el nucleófilo que ataca y se une al fosfato 5' del primer nucleótido del intrón. Esto deja el 3'‑OH del último nucleótido del exón aguas arriba disponible para atacar y unirse al fosfato 5' del primer nucleótido del exón aguas abajo. Estas dos transferencias de fosfoéster dan como resultado una unión de los dos exones y la escisión del intrón (con el nucleótido G de inicio unido al extremo 5'). El intrón escindido es circularizado luego por ataque del 3'‑OH del último nucleótido del intrón sobre el fosfato entre los nucleótidos 15 y 16 de los intrones. La degradación adicional elimina eficazmente el intrón de la reacción y ayuda a evitar que ocurra la reacción inversa. Tenga en cuenta que las transferencias de fosfoéster son fácilmente reversibles a menos que se eliminen los productos (intrón escindido). No hay incremento ni disminución en el número de enlaces fosfoéster durante este empalme.
El Intrón es el Catalizador para Empalmar en este Sistema
La implicación del ARN en el autocorte y empalme es estequiométrica, pero el intrón escindido tiene actividad catalítica in vitro. Después de una serie de reacciones de ciclación y escisión intramoleculares, el intrón escindido lineal que carece de 19 nucleótidos (llamado L-19 IVS) puede usarse catalíticamente para agregar y eliminar nucleótidos a un sustrato artificial. Por ejemplo, C5, que es complementario a las secuencias guía internas del intrón, puede convertirse en C4 + C6 y otros productos (Figura 3.3.12).
La estructura 3‑D del ARN plegado es responsable de la especificidad y eficiencia de la reacción (análoga a las ideas generales sobre proteínas con actividad enzimática). La especificidad del empalme es causada, al menos en parte, por el emparejamiento de bases entre el extremo 3' del exón aguas arriba y una región en el intrón llamada secuencia guía interna. El G nt de inicio también se une a un sitio específico en el ARN cerca del sitio de empalme 5'. Así, dos sitios en el intrón pre-ARNr se utilizan secuencialmente en el corte y empalme (Figura 3.3.13 A y 3.3.13.B.).
Figura 3.3.13.A.
La secuencia guía interna (IGS) no es necesaria para la catálisis pero sí confiere especificidad. Por lo tanto, se pueden diseñar ARN para el intercambio de exones en las células. Esta vía potencial para la terapia para los trastornos genéticos se llama “terapia de reemplazo de exones.
