12.6: Empalme de intrones en pre-ARNm
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1. Sitios de Empalme
La secuencia en los extremos 5' y 3' de los intrones en pre-ARNm está muy conservada. Por lo tanto, se puede derivar una secuencia consenso para las uniones de empalme.
5' exón... AG' GU RAGU... YYYYYYYYYNC AG 'G... exón
El GU es el sitio de empalme 5' (a veces llamado sitio de empalme donante) y el AG es el sitio de empalme 3' (o sitio de empalme aceptor). GU es invariante en el sitio de empalme 5', y AG es (casi) invariante en el sitio de corte y empalme 3' para la clase más prevalente de intrones en pre-ARNm.
Los efectos de las mutaciones en las uniones de empalme demuestran su importancia en el mecanismo de corte y empalme. La mutación del GT en el sitio donante en el ADN a una AT evita el corte y empalme (esto se observó en una mutación del gen b‑globina que causó la talasemia b0). Una mutación diferente del gen de la b‑globina que generó un nuevo sitio de empalme provocó que se elaborara un ARN aberrante, lo que resultó en la producción de bajos niveles de b‑globina (b+ talasemia).
2. El intrón se extirpa como un lariat
El 2'‑OH de una A en el punto de “ramificación” forma un fosfoéster con la primera G del intrón para iniciar el corte y empalme. El empalme ocurre por una serie de transferencias de fosfoéster (también llamadas transesterificaciones). Después de que el 2'-OH de la A en la rama se haya unido a la G inicial del intrón, el 3'‑OH del exón aguas arriba está disponible para reaccionar con el primer nucleótido del exón aguas abajo, uniendo así los dos exones a través del mecanismo de transferencia de fosfoéster.
c. Intron lariat es el equivalente de un intermedio “circular”.
La secuencia en el punto de ramificación solo se conserva moderadamente en la mayoría de las especies; el examen de muchos puntos de ramificación da el consenso YNYYRAG. Se encuentra de 18 a 40 nucleótidos aguas arriba del sitio de empalme 3'.
3. Las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (o snRNP) forman el empalme funcional en pre-ARNm y catalizan el empalme.
a. ARN “U” y proteínas asociadas. Los ARN nucleares pequeños (ARNsn) tienen aproximadamente 100 a 300 nts de largo y pueden ser tan abundantes como 105 a 106 moléculas por célula. Se llaman U seguido de un número entero. Los principales involucrados en el empalme son los ARNsn U1, U2, U4/U6 y U5. Se conservan de levadura a humanos. Los ARNsn están asociados con proteínas para formar pequeñas partículas de ribonucleoproteína nuclear, o snRNP. Los snRNP se denominan por los ARNsn que contienen, de ahí que los principales involucrados en el corte y empalme son los snRNP U1, U2, U4/U6, U5.
Una clase de proteínas comunes a muchos snRNP son las proteínas Sm. Existen 7 proteínas Sm, llamadas B/B', D1, D2, D3, E, F, G. Cada proteína Sm tiene una estructura similar en 3-D, que consiste en una hélice alfa seguida de 5 cadenas beta. Las proteínas Sm interactúan a través de las cadenas beta y pueden formar un círculo alrededor del ARN.
Una secuencia particular común a muchos ARNsn es reconocida por las proteínas Sm, y se llama el “motivo de ARN Sm”.
b. Uso de anticuerpos de pacientes con LES. Varios de los SNRNP comunes son reconocidos por el suero autoinmune llamado Anti-SM, generado inicialmente por pacientes con la enfermedad autoinmune Lupus Eritematosis Sistémico. Uno de los primeros experimentos críticos que muestran la importancia de los snRNP en el corte y empalme fue la demostración de que los antisueros anti-Sm son un potente inhibidor de las reacciones de corte y empalme in vitro. Así, las dianas de los antisueros, es decir, proteínas Sm en snRNP, son necesarias para el corte y empalme.
c. Los snRNP se ensamblan sobre el pre-ARNm para hacer un gran complejo proteína-ARN llamado spliceosoma (Figura 3.3.17). La catálisis del empalme ocurre dentro del spliceosoma. Estudios recientes apoyan la hipótesis de que los componentes de ARNsn del spliceosoma realmente catalizan el empalme, proporcionando otro ejemplo de ribozimas.
d. U1 snRNP: Se une al sitio de empalme 5', y el ARN U1 forma una estructura de base pareada con el sitio de empalme 5'.
e. snRNP U2: Se une al punto de ramificación y forma un dúplex ARN-ARN corto. Esta etapa requiere un factor a uxiliar (U2AF) e hidrólisis de ATP, y compromete el pre-ARNm a la vía de corte y empalme.
f. U5 snRNP más el U4, U6 snRNP ahora se unen para ensamblar el spliceosoma funcional. La evidencia indica que U4 snRNP se disocia del U6 snRNP en el spliceosoma. Esto permite entonces que el ARN U6 forme nuevas estructuras pares de bases con el ARN U2 y el pre-ARNm que catalizan la reacción de transesterificación (transferencias de fosfoéster). Un modelo es que el ARN U6 se empareja con el sitio de empalme 5' y con el ARN U2 (que a su vez está emparejado con el punto de ramificación), acercando así el punto de ramificación A al sitio de empalme 5'. El ARN U5 puede servir para mantener juntos los extremos de los exones a unir.
4. Empalme trans
Todo el corte y empalme que hemos discutido hasta ahora es entre exones en la misma molécula de ARN, pero en algunos casos los exones pueden ser empalmados a otros ARN. Esto es muy común en los tripanosomas, en los que se encuentra una secuencia líder empalmada en los extremos 5' de casi todos los ARNm. Se han descrito algunos ejemplos de corte y empalme trans en células de mamífero.