20.E: Regulación transcripcional a través de alteraciones de la cromatina (Ejercicios)

Utilice la siguiente información para responder a las dos preguntas siguientes.

Los sitios hipersensibles a la ADNasa alrededor de un gen se mapearon tratando núcleos de células que expresan ese gen con cantidades crecientes de ADNasa I. El ADN parcialmente digerido se aisló, se cortó hasta su finalización con una enzima de restricción y se analizó mediante hibridación de transferencia Southern utilizando una sonda radiactiva que se encuentra a 3' del gen. La escisión del ADN genómico con la enzima de restricción genera un fragmento de 8 kb que contiene el gen, y la sonda para la hibridación por transferencia se localiza en el extremo derecho del fragmento (de izquierda a derecha definida como la dirección de transcripción del gen). Los resultados de este ensayo indirecto de marcaje final muestran un desvanecimiento gradual del fragmento de 8 kb con [DNasaI] creciente, y la aparición de una nueva banda a 6 kb con tratamiento con DNasaI.

20.1 ¿Dónde está el sitio hipersensible a la DNasa I?

20.2 Si el sitio de inicio de la transcripción está a 5 kb del extremo derecho del fragmento de restricción, ¿cuál es la posibilidad probable para la función de la región mapeada por el sitio hipersensible a la ADNasa?

Para las siguientes tres preguntas, considere la siguiente información sobre una proteína llamada GCN5p. [Este problema se basa en Brownell et al. (1996) Cell 84:843-851.]

[1] GCN5p es necesario para la activación de algunos, pero no todos, genes en levaduras.

[2] GCN5p no se une con alta afinidad a ningún sitio en particular en el ADN.

[3] GCN5p interactuará con activadores transcripcionales ácidos.

[4] Cuando se incuba con histonas y los siguientes sustratos, GCN5p tendrá los efectos designados. A + en la columna bajo “Efecto” significa que las histonas se mueven más lentamente que las histonas no modificadas en un gel de poliacrilamida que se separa en base a la carga, moviéndose las histonas hacia el electrodo cargado negativamente. A - significa que el tratamiento no tiene efecto sobre las histonas. La S-adenosilmetionina es un sustrato para algunas reacciones de transferencia de metilo, y el NADH es el sustrato para las adpribosil-transferasas.

Efecto de mezcla

GCN5p + histonas -

GCN5p + histonas + ATP -

GCN5p + histonas + S-adenosilmetionina -

GCN5p + histonas + acetil-coenzima A +

GCN5p + histonas + NADH -

20.3 ¿Qué conclusión concuerda con estas observaciones?

20.4 ¿Qué actividad enzimática está asociada a GCN5p?

20.5 ¿Qué paso en la vía de expresión génica es probable que esté regulado por GCN5p?

20.6 ¿Qué funciones se han atribuido a la región de control de locus de genes de beta-globina de mamíferos?

20.7 Utiliza la siguiente información para responder a las siguientes 6 partes (a-f) de esta pregunta. El esquema regulatorio es imaginario pero ilustrativo de algunos de los modelos que hemos discutido.

La proteína surfactina se produce en el pulmón para proporcionar área de superficie para un intercambio de gases eficiente en los alvéolos. Supongamos que la expresión del gen de la surfactina es inducida en las células pulmonares por una nueva hormona polipeptídica llamada pulmonina. La inducción por pulmonina requiere una secuencia de ADN particular aguas arriba del gen de la surfactina; esto se llama PRE para p ulmonina r esponse e lement. Se aislaron proteínas que se unen específicamente a ese sitio, y la fracción más altamente purificada que se une al PRE contenía dos polipéptidos. Se aisló un clon de ADNc que codificaba uno de los polipéptidos llamados NFL2. Antisueros que reconocen específicamente NFL2 está disponible.

El mecanismo de inducción por pulmonina se investigó analizando diversas fracciones celulares (nucleares o citoplásmicas) de células pulmonares no inducidas o inducidas por pulmón en dos ensayos. La presencia o ausencia del polipéptido NFL2 se determinó reaccionando con los antisueros anti-NFL2, y se probó la capacidad de unirse a la secuencia de ADN PRE mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética. En otra serie de experimentos, el polipéptido NFL2 se sintetizó in vitro transcribiendo el clon de ADNc y traduciendo ese ARNm artificial. “El producto tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido nativo y se denomina a continuación como “" ADNc expresado "”.” El ADNc expresado (que es el polipéptido sintetizado in vitro) se probó en los mismos ensayos, antes y después del tratamiento con los extractos citoplásmicos y nucleares y también con una proteína quinasa que fosforilará el ADNc expresado en una serina específica.

Línea	Fuente de proteína y tipo de tratamiento	Reaccionar con Anti-NFL2	Se une al ADN PRE
1	Extracto citoplásmico celular no inducido = unind. CE	+	‑
2	Extracto nuclear celular no inducido = unind. NE	‑	‑
3	Extracto citoplásmico celular inducido = ind. CE	‑	‑
4	Extracto nuclear celular inducido = ind. NE	+	+
5	Extracto nuclear celular inducido + fosfatasa	+	‑
6	ADNc expresado	+	‑
7	CADN expresado + ind. CE	+	‑
8	CADN expresado + unind. NE	+	‑
9	CADN expresado + ind. CE + unind. NE	+	+
10	CADN expresado + unind. CE + unind. NE	+	‑
11	CADN expresado + proteína quinasa + ATP	+	‑
12	Expresado ADNc + proteína quinasa + ATP + unind. NE	+	+
13	CADN expresado + proteína quinasa + ATP + ind. CE	+	‑

Con base en estos datos, se realizó una columna de afinidad con el ADNc de NFL2 expresado como ligando y se utilizó para probar la unión de proteínas de extractos nucleares. Cuando la columna se pretrató con proteína quinasa + ATP (de manera que NFL2 se fosforiló), una proteína nuclear ubicua llamada UBF3 se enlazó a partir de extractos nucleares tanto de células inducidas como no inducidas. Si el ligando NFL2 no estaba fosforilado, no se observó unión de proteínas nucleares.

Para confirmar que NFL2 realmente era parte del complejo proteico en PRE, se demostró que los anticuerpos contra NFL2 reaccionaban con este complejo proteína-ADN. Además, los anticuerpos contra la fosfoserina, pero no los anticuerpos contra la fosfotirosina, reaccionaron con el complejo preproteico específico.

Responder a las preguntas de la a a la f con base en las observaciones anteriores.

a) ¿Dónde está el polipéptido NFL2? (Utilice los datos en las líneas 1‑5.)

b) ¿Dónde está la actividad que se unirá al sitio PRE en el ADN? (Utilice los datos en las líneas 1‑5.)

c) A partir de los datos de las líneas 6-13, ¿qué debe suceder con el NFL2 sintetizado in vitro (el ADNc expresado) para unirse al sitio PRE?

d) ¿Qué proteínas y modificaciones covalentes de las mismas se requieren para unirse al sitio PRE?

e) ¿Qué compartimento celular tiene la proteína quinasa que actúa sobre NFL2?

f) ¿Qué modelo de inducción de pulmonina del gen de la surfactina se ajusta mejor a los datos dados?