12.2J: Procedimientos de Inmunotransferencia

La inmunotransferencia es una técnica para analizar proteínas a través de reacciones específicas antígeno-anticuerpo.

Objetivos de aprendizaje

• Describir cómo la transferencia Western permite a los individuos detectar proteínas solubilizadas específicas a partir de suero o extractos celulares o tisulares

Puntos Clave

• En técnicas de inmunotransferencia como el análisis de transferencia Western, las proteínas se separan por electroforesis y se transfieren a láminas de nitrocelulosa, luego se identifican por su reacción con anticuerpos marcados.
• La electroforesis utiliza una corriente eléctrica para separar las proteínas en función de su tamaño. Las proteínas grandes migran más lentamente y están representadas por las bandas más altas en la transferencia, mientras que las proteínas pequeñas migran más rápido y están indicadas por las bandas más bajas en la transferencia.
• Los ensayos de inmunotransferencia generalmente se realizan para confirmar los resultados obtenidos por otras técnicas como ELISA.

Términos Clave

• dodecil sulfato de sodio: agente detergente fuerte utilizado para reducir y desplegar la proteína nativa.
• blot: método de transferencia de proteína, ADN o ARN a una membrana portadora.

Los procedimientos de inmunotransferencia como la transferencia de proteínas, o la transferencia Western, permiten a los individuos detectar proteínas solubilizadas específicas a partir de extractos hechos de células o tejidos, antes o después de cualquier paso de purificación.

Procedimientos de inmunotransferencia

Figura: Inmunotransferencia: proteínas separadas por peso molecular y representadas por una banda oscura en una transferencia.

Esta técnica analítica procede en los siguientes pasos. Las proteínas generalmente se separan por tamaño usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de esto, se transfieren a una membrana sintética mediante métodos de transferencia seca, semiseca o húmeda. En el campo eléctrico generado por una fuente de alimentación, las proteínas recubiertas con SDS con carga negativa migran hacia el electrodo positivo. A medida que las proteínas migran fuera del gel, son capturadas en una membrana. La unión de proteínas a la membrana es un mecanismo irreversible. Las membranas pueden ser de la variedad de nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno (PVDF) o nailon. La membrana puede bloquearse entonces con albúmina sérica o solución láctea para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. A esto le sigue el sondeo con anticuerpos específicos de la proteína que se estudia en la membrana, un método que es similar a la inmunohistoquímica, pero sin necesidad de fijación. Esta técnica explota la especificidad inherente al reconocimiento antígeno-anticuerpo. La detección se realiza típicamente usando anticuerpos secundarios unidos a cromógeno o peróxido para catalizar una reacción cromogénica o quimioluminiscente.

Aplicaciones de Inmunotransferencia

La transferencia Western es un método rutinario de biología molecular que se puede utilizar para comparar semicuantitativamente los niveles de proteína entre extractos. La separación por tamaños, previa a la transferencia, permite medir el peso molecular de la proteína, en comparación con los marcadores de peso molecular conocidos. Las inmunotransferencias se utilizan con mayor frecuencia en entornos de investigación y generalmente se realizan para confirmar los resultados de ELISA u otros inmunoensayos. En entornos de diagnóstico clínico se aplica la inmunoelectroforesis, la cual implica la electroforesis de suero u orina seguida de inmunodifusión. El tamaño y posición de las bandas de precipitación proporciona el mismo tipo de información sobre la cantidad de anticuerpos que el método de doble inmunodifusión.