3.3E: Micropscopia Confocal
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Objetivos de aprendizaje
- Comparar y contrastar microscopía confocal y de fluorescencia
La microscopía confocal es una técnica de imagen fluorescente no invasiva que utiliza láseres de varios colores para escanear a través de una muestra con la ayuda de espejos de escaneo. El punto de iluminación es llevado al foco en el espécimen por la lente objetivo. El proceso de escaneo utiliza un dispositivo que está bajo control informático. Las secuencias de puntos de luz del espécimen son detectadas por un tubo fotomultiplicador a través de un estenopeico. La salida se construye en una imagen y se transfiere a una pantalla de computadora digital para su posterior análisis. La técnica emplea seccionamiento óptico para tomar cortes seriales de la imagen. Luego se apilan las rebanadas (pila Z) para reconstruir la imagen tridimensional de la muestra biológica. El seccionamiento óptico es útil para determinar la localización celular de las dianas. La muestra biológica a estudiar se tiñe con anticuerpos unidos químicamente a colorantes fluorescentes similares al método empleado en microscopía de fluorescencia. A diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional donde la fluorescencia se emite a lo largo de todo el cono iluminado creando una imagen nebulosa, en la microscopía confocal se agrega el estenopeico para permitir el paso de luz que proviene de un punto focal específico sobre la muestra y no del otro. La luz detectada crea una imagen que está enfocada con la muestra original. La microscopía confocal tiene múltiples aplicaciones en microbiología como el estudio de biopelículas y cepas de bacterias resistentes a antibióticos. El desarrollo de microscopios confocales modernos se ha visto acelerado por los nuevos avances en tecnología informática y de almacenamiento, sistemas láser, detectores, filtros de interferencia y fluoróforos para objetivos altamente específicos.
Puntos Clave
- La microscopía confocal requiere tinción de inmunofluorescencia de muestras biológicas.
- La microscopía confocal sirve para controlar la profundidad de campo, eliminar el fondo y recolectar secciones ópticas.
- El uso de la microscopía confocal se ha ampliado para estudiar células fijas y vivas con la capacidad de cuantificar dianas.
Términos Clave
- Tubo fotomultiplicador: Un tubo de vacío que detecta luz ultravioleta, visible y cerca del infrarrojo y la multiplica 100 millones de veces.