3.3D: Microscopía de Fluorescencia
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Objetivos de aprendizaje
- Describir las técnicas, ventajas y desventajas de la microscopía de fluorescencia
El microscopio fluorescente utiliza una lámpara de vapor de mercurio, halógeno o xenón de alta presión que emite una longitud de onda más corta que la emitida por la microscopía de campo claro tradicional. Estas fuentes de luz producen luz ultravioleta. Cuando la luz ultravioleta golpea un objeto, excita los electrones del objeto, y emiten luz en varios tonos de color. Dado que se utiliza la luz ultravioleta se puede recabar una mayor cantidad de información; así, la resolución del objeto aumenta.
Técnica de anticuerpos fluorescentes y colorantes
Esta técnica de laboratorio emplea colorantes fluorescentes químicamente ligados a anticuerpos para ayudar a identificar microorganismos desconocidos. Este método utiliza la especificidad de un anticuerpo a su antígeno para suministrar un colorante fluorescente a una molécula diana. Se utiliza un filtro para bloquear el calor generado por la lámpara y para que coincida con el colorante fluorescente que marca la muestra. Un filtro de barrera adicional entre el objetivo y el detector puede filtrar la luz de excitación restante de la luz fluorescente.
Los tintes fluorescentes, moléculas que absorben luz de una longitud de onda y luego la vuelven a emitir a una longitud de onda visible más larga, se pueden usar solos o en combinación para obtener especificidad de la estructura teñida que se visualiza. La luz emitida por el fluoróforo se magnifica a través de objetivos tradicionales y lentes oculares. La tinción de organismos con estos tintes especiales reduce la autofluorescencia inespecífica que algunos organismos pueden emitir. Las células u organismos teñidos con fluorocromos aparecen coloreados contra un fondo oscuro cuando se fijan en un portaobjetos de vidrio. La microscopía de fluorescencia no permite el examen de microorganismos vivos ya que requiere que sean fijados y permeabilizados para que el anticuerpo penetre en el interior de las células.
Puntos Clave
- En microscopía de fluorescencia, las muestras se tiñen primero con fluorocromos y luego se ven a través de un microscopio compuesto usando una fuente de luz ultravioleta (o casi ultravioleta).
- Los microorganismos aparecen como objetos brillantes sobre un fondo oscuro.
- La microscopía de fluorescencia se utiliza principalmente en un procedimiento llamado técnica de anticuerpos fluorescentes (FA), o inmunofluorescencia.
Términos Clave
- autofluorescencia: Fluorescencia autoinducida
- halógeno: cualquier elemento del grupo 7, es decir, flúor, cloro, bromo, yodo y astatina, que forman una sal por unión directa con un metal