7.3A: Conceptos básicos de la replicación del ADN

La replicación del ADN utiliza un método semi-conservador que da como resultado un ADN bicatenario con una cadena parental y una nueva cadena hija.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Explicar cómo el experimento de Meselson y Stahl estableció de manera concluyente que la replicación del ADN es semi-conservadora.

Principales conclusiones

Puntos Clave

• Se sugirieron tres modelos para la replicación del ADN: conservador, semiconservador y dispersivo.
• El método conservador de replicación sugiere que el ADN parental permanece unido y las hebras hijas recién formadas también están juntas.
• El método semi-conservador de replicación sugiere que las dos cadenas de ADN parentales sirven como molde para ADN nuevo y después de la replicación, cada ADN bicatenario contiene una hebra del ADN parental y una nueva hebra (hija).
• El método dispersivo de replicación sugiere que, después de la replicación, los dos ADN hijos tienen segmentos alternantes de ADN parental y recién sintetizado intercalados en ambas cadenas.
• Meselson y Stahl, utilizando ADN de E. coli elaborado con dos ítopos de nitrógeno (¹⁴ N y ¹⁵ N) y centrifugación en gradiente de densidad, determinaron que el ADN se replicó mediante el método semi-conservador de replicación.

Términos Clave

• Replicación del ADN: un proceso biológico que ocurre en todos los organismos vivos que es la base de la herencia biológica
• isótopo: cualquiera de dos o más formas de un elemento donde los átomos tienen el mismo número de protones, pero un número diferente de neutrones dentro de sus núcleos

Fundamentos de la replicación del ADN

El descubrimiento de Watson y Crick de que el ADN era una doble hélice bicatenaria proporcionó una pista sobre cómo se replica el ADN. Durante la división celular, cada molécula de ADN tiene que copiarse perfectamente para asegurar que moléculas de ADN idénticas se muevan a cada una de las dos células hijas. La estructura bicatenaria del ADN sugiere que las dos cadenas podrían separarse durante la replicación, sirviendo cada cadena como molde a partir del cual se copia la nueva cadena complementaria para cada una, generando dos moléculas bicatenarias a partir de una.

Modelos de Replicación

Hubo tres modelos de replicación posibles a partir de dicho esquema: conservador, semiconservador y dispersivo. En la replicación conservadora, las dos cadenas de ADN originales, conocidas como las cadenas parentales, se volverían a formar bases entre sí después de ser utilizadas como plantillas para sintetizar nuevas cadenas; y las dos cadenas recién sintetizadas, conocidas como las hebras hijas, también aparecerían entre sí; una de las dos cadenas de ADN las moléculas después de la replicación serían “totalmente antiguas” y la otra sería “completamente nueva”. En la replicación semiconservadora, cada una de las dos cadenas de ADN parentales actuaría como un molde para que se sintetizaran nuevas cadenas de ADN, pero después de la replicación, cada cadena de ADN parental formaría bases con la cadena complementaria recién sintetizada recién sintetizada, y ambos ADN bicatenarios incluirían uno parental o “vieja” y una rama hija o “nueva”. En la replicación dispersiva, después de la replicación ambas copias de los nuevos ADN tendrían de alguna manera segmentos alternantes de ADN parental y ADN recién sintetizado en cada una de sus dos cadenas.

Figura: Modelos sugeridos de replicación de ADN: Los tres modelos sugeridos de replicación de ADN. El gris indica las cadenas o segmentos originales de ADN parental y el azul indica cadenas o segmentos de ADN hijos recién sintetizados.

Para determinar qué modelo de replicación era exacto, en 1958 se realizó un experimento seminal por dos investigadores: Matthew Meselson y Franklin Stahl.

Meselson y Stahl

Meselson y Stahl estaban interesados en entender cómo se replica el ADN. Cultivaron E. coli durante varias generaciones en un medio que contenía un isótopo “pesado” de nitrógeno (¹⁵ N) que se incorpora en bases nitrogenadas y, finalmente, en el ADN. El cultivo de E. coli se desplazó a medio que contenía el isótopo “ligero” común de nitrógeno (¹⁴ N) y se dejó crecer durante una generación. Se cosecharon las células y se aisló el ADN. El ADN se centrifugó a altas velocidades en una ultracentrífuga en un tubo en el que se había establecido un gradiente de densidad de cloruro de cesio. Algunas células se dejaron crecer durante un ciclo de vida más en ¹⁴ N y se volvieron a centrifugar.

Figura: Meselson y Stahl: Meselson y Stahl experimentaron con E. coli cultivada primero en nitrógeno pesado (¹⁵ N) luego en nitrógeno más ligero (¹⁴ N.) El ADN cultivado en ¹⁵ N (banda roja) es más pesado que el ADN cultivado en ¹⁴ N (banda naranja) y los sedimentos a un nivel inferior en el gradiente de densidad de cloruro de cesio en una ultracentrífuga. Cuando el ADN cultivado en ¹⁵ N se cambia a medio que contiene ¹⁴ N, después de una ronda de división celular el ADN se sedimenta a medio camino entre los niveles de ¹⁵ N y ¹⁴ N, lo que indica que ahora contiene cincuenta por ciento ¹⁴ N y cincuenta por ciento ¹⁵ N.. En divisiones celulares posteriores, una cantidad creciente de ADN contiene solo ¹⁴ N. Estos datos soportan el modelo de replicación semi-conservadora.

Durante la ultracentrifugación con gradiente de densidad, el ADN se cargó en un gradiente (Meselson y Stahl utilizaron un gradiente de sal de cloruro de cesio, aunque también se pueden usar otros materiales como la sacarosa para crear un gradiente) y se hilaron a altas velocidades de 50,000 a 60,000 rpm. En el tubo de ultracentrífuga, la sal de cloruro de cesio creó un gradiente de densidad, siendo la solución de cloruro de cesio más densa cuanto más abajo del tubo se iba. En estas circunstancias, durante el centrifugado el ADN se tiró por el tubo de ultracentrífuga por fuerza centrífuga hasta llegar al punto en el gradiente de sal donde la densidad de las moléculas de ADN coincidió con la de la solución salina circundante. En ese punto, las moléculas dejaron de sedimentarse y formaron una banda estable. Al observar las posiciones relativas de las bandas de moléculas que se ejecutan en los mismos gradientes, se pueden determinar las densidades relativas de diferentes moléculas. Las moléculas que forman las bandas más bajas tienen las densidades más altas.

El ADN de células cultivadas exclusivamente en ¹⁵ N produjo una banda menor que el ADN de células cultivadas exclusivamente en ¹⁴ N. Así que el ADN cultivado en ¹⁵ N tuvo una mayor densidad, como sería de esperar de una molécula con un isótopo más pesado de nitrógeno incorporado a sus bases nitrogenadas. Meselson y Stahl señalaron que después de una generación de crecimiento en ¹⁴ N (después de que las células se habían desplazado de ¹⁵ N), las moléculas de ADN produjeron solo una banda intermedia en posición entre ADN de células cultivadas exclusivamente en ¹⁵ N y ADN de células cultivadas exclusivamente en ¹⁴ N. Esto sugirió un modo de replicación semiconservador o dispersivo. La replicación conservadora habría resultado en dos bandas; una representando el ADN parental todavía con exclusivamente ¹⁵ N en sus bases nitrogenadas y la otra representando el ADN hijo con exclusivamente ¹⁴ N en sus bases nitrogenadas. La única banda realmente vista indicó que todas las moléculas de ADN contenían cantidades iguales tanto de ¹⁵ N como de ¹⁴ N.

El ADN recolectado de células cultivadas durante dos generaciones en ¹⁴ N formó dos bandas: una banda de ADN estaba en la posición intermedia entre ¹⁵ N y ¹⁴ N y la otra correspondió a la banda de ADN exclusivamente ¹⁴ N. Estos resultados solo podrían explicarse si el ADN se replica de manera semiconservadora. La replicación dispersiva habría resultado exclusivamente en una sola banda en cada nueva generación, con la banda moviéndose lentamente hacia arriba más cerca de la altura de la banda de ADN de ¹⁴ N. Por lo tanto, también se podría descartar la replicación dispersiva.

Los resultados de Meselson y Stahl establecieron que durante la replicación del ADN, cada una de las dos cadenas que componen la doble hélice sirve como molde a partir del cual se sintetizan nuevas cadenas. La nueva hebra será complementaria a la hebra parental o “vieja” y la nueva hebra permanecerá pegada a la hebra vieja. Así que cada ADN “hija” en realidad consiste en una hebra de ADN “vieja” y una hebra recién sintetizada. Cuando se forman dos copias de ADN hija, tienen las secuencias idénticas entre sí y secuencias idénticas al ADN parental original, y los dos ADN hijos se dividen por igual en las dos células hijas, produciendo células hijas que son genéticamente idénticas entre sí y genéticamente idéntico a la celda padre.