7.13D: Sintetizar ADN

Objetivos de aprendizaje

• Resumir los métodos y usos de la síntesis de ADN

Para entender la genética bacteriana, se debe entender el material genético subyacente (es decir, el ADN). El ADN debe sintetizarse para estudiar genes, la secuencia de genomas y muchos otros estudios. Esto ocurre de dos maneras, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que es síntesis enzimática y química. La PCR está cubierta en otro átomo. Aquí nos centraremos en la síntesis química del ADN, que también se conoce como síntesis de oligonucleótidos.

La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos, tanto de ADN como de ARN con una estructura química definida (secuencia). La técnica es extremadamente útil en la práctica de laboratorio actual porque proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos hechos a medida de la secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una dirección 5' a 3′, la síntesis química de oligonucleótidos se lleva a cabo en la dirección opuesta, de 3′ a 5′.

Figura: Oligosíntesis. : Aquí se describen las complejas reacciones químicas que se necesitan para acoplar un nucleótido a otro.

Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida usando el método de fosforamidita y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2′-desoxinucleósidos protegidos (dA, dC, dG y T), ribonucleósidos (A, C, G y U) o nucleósidos modificados químicamente, por ejemplo, LNA. Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques constructivos se acoplan secuencialmente a la cadena oligonucleotídica en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto. El proceso ha sido completamente automatizado desde finales de la década de 1970. Al finalizar el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recolecta. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótidos) debido a que el número de errores se acumula con la longitud del oligonucleótido que se sintetiza. Los productos a menudo se aíslan por HPLC para obtener los oligonucleótidos deseados en alta pureza. Por lo general, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN monocatenarias de alrededor de 15 a 25 bases de longitud. Los oligonucleótidos encuentran una variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Se utilizan más comúnmente como oligonucleótidos antisentido, ARN interferente pequeño, cebadores para secuenciación y amplificación de ADN, sondas para detectar ADN o ARN complementario mediante hibridación molecular, herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción, y para la síntesis de genes.

Una aplicación adicional de la oligosíntesis es hacer genes artificiales. La síntesis génica artificial es el proceso de sintetizar un gen in vitro sin la necesidad de muestras iniciales de ADN molde. El método principal es actualmente por síntesis de oligonucleótidos (también utilizada para otras aplicaciones) a partir de secuencias genéticas digitales y posterior hibridación de los fragmentos resultantes. Por el contrario, la replicación natural del ADN requiere plantillas de ADN existentes para sintetizar nuevo ADN.

Puntos Clave

• El ADN y el ARN son en su esencia estructuras químicas, y como tales reacciones químicas complejas se pueden utilizar para sintetizarlos.
• Existen formas enzimáticas de amplificar el ADN, notablemente la PCR, mientras que las secuencias de ADN pueden sintetizarse químicamente mediante un proceso conocido como oligosíntesis.
• La oligosíntesis se puede utilizar para hacer genes artificiales, lo que permite a los científicos diseñar y sintetizar nuevos productos génicos, sin depender de una plantilla de un gen que se encuentra en la naturaleza.

Términos Clave

• fosforamidita: Cualquiera de una clase de compuestos orgánicos derivados formalmente de un fosfito al reemplazar un >P-O-R por un grupo >P-N<R2; utilizado en la síntesis de ácidos nucleicos, etc.
• HPLC: La cromatografía líquida de alto rendimiento (a veces denominada cromatografía líquida de alta presión), HPLC, es una técnica cromatográfica utilizada para separar una mezcla de compuestos en química analítica y bioquímica con el propósito de identificar, cuantificar y purificar al individuo componentes de la mezcla.