7.13E: Amplificar ADN - La Reacción en Cadena de la Polimerasa

Objetivos de aprendizaje

• Ilustrar las aplicaciones, componentes y pasos de la PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una tecnología bioquímica en biología molecular utilizada para amplificar una sola, o algunas copias, de una pieza de ADN en varios órdenes de magnitud, generando de miles a millones de copias de una secuencia de ADN en particular.

Aplicaciones

Desarrollada en 1983 por Kary Mullis, la PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable utilizada en laboratorios de investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones, incluyendo las siguientes:

• Clonación de ADN para secuenciación; filogenia basada en ADN o análisis funcional de genes
• El diagnóstico de enfermedades hereditarias
• La identificación de huellas genéticas (utilizadas en ciencias forenses y pruebas de paternidad)
• La detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas

El método se basa en el ciclo térmico, que consiste en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión del ADN y la replicación enzimática del ADN. Los cebadores (fragmentos cortos de ADN) que contienen secuencias complementarias a la región diana, junto con una ADN polimerasa (después de la cual se nombra el método) son componentes clave para permitir la amplificación selectiva y repetida. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se usa en sí mismo como molde para la replicación, poniendo en movimiento una reacción en cadena en la que el molde de ADN se amplifica exponencialmente. La PCR se puede modificar extensivamente para realizar una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Componentes

La PCR se usa para amplificar una región específica de una cadena de ADN (la diana de ADN). La mayoría de los métodos de PCR típicamente amplifican fragmentos de ADN de hasta ~10 pares de bases (kb), aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kb de tamaño. La reacción produce una cantidad limitada de producto final amplificado que se rige por los reactivos disponibles en la reacción, y la inhibición de retroalimentación de los productos de reacción. Una configuración básica de PCR requiere los siguientes componentes y reactivos:

• Plantilla de ADN que contiene la región de ADN (diana) que se va a amplificar
• Dos cebadores que son complementarios a los extremos 3' (tres primos) de cada una de las cadenas sentido y antisentido de la diana de ADN
• Taq polimerasa u otra ADN polimerasa con una temperatura óptima alrededor de 70 °C
• Desoxinnucleósidos trifosfatos (dNTPs; nucleótidos que contienen grupos trifosfato), los bloques de construcción a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN
• Solución tampón, proporcionando un ambiente químico adecuado para una óptima actividad y estabilidad de la ADN polimerasa.Cationes divalentes, iones magnesio o manganeso; generalmente Mg2+
• Cationes monovalentes iones potasio

Por lo general, la PCR consiste en una serie de 20-40 cambios repetidos de temperatura, llamados ciclos, con cada ciclo comúnmente consistente en dos a tres pasos de temperatura discretos, generalmente tres. Las temperaturas utilizadas, y el tiempo que se aplican en cada ciclo, dependen de una variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores.

Pasos

Los siguientes son los pasos de la PCR:

Figura: Las etapas de la PCR: Esto ilustra una reacción de PCR para demostrar cómo la amplificación conduce al crecimiento exponencial de un producto corto flanqueado por los cebadores. 1. Desnaturalizante a 96°C. 2. Recocido a 68°C. 3. Elongación a 72°C. El primer ciclo está completo. Las dos cadenas de ADN resultantes conforman el ADN molde para el siguiente ciclo, duplicando así la cantidad de ADN duplicado para cada nuevo ciclo.

1. Etapa de desnaturalización: Este paso es el primer evento de ciclo regular y consiste en calentar la reacción a 94-98°C, provoca la fusión del ADN del molde de ADN al romper los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, produciendo moléculas de ADN monocatenario.
2. Etapa de recocido: La temperatura de reacción se reduce a 50-65°C durante 20-40 segundos permitiendo la reasociación de los cebadores con el molde de ADN monocatenario.
3. Etapa de extensión/elongación: La temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa utilizada; la Taq polimerasa tiene su temperatura de actividad óptima a 75-80°C, y comúnmente se usa una temperatura de 72°C con esta enzima. En esta etapa la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde de ADN agregando dNTPs que son complementarios al molde en dirección 5' a 3', condensando el grupo 5′-fosfato de los dNTPs con el grupo 3′-hidroxilo al final de la cadena de ADN naciente (extensible).

Después de la elongación, el ciclo vuelve al paso uno, generalmente para 20-40 ciclos. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes) en cada etapa de extensión, la cantidad de ADN diana se duplica, lo que lleva a la amplificación exponencial (geométrica) del fragmento de ADN específico.

Puntos Clave

• La PCR se usa para amplificar una región específica de ADN.
• La PCR consiste típicamente en tres etapas: desnaturalización, reasociación y elongación.
• El ADN amplificado puede ser utilizado para muchos propósitos, como identificar diferentes genes y especies de bacterias.

Términos Clave

• apareamiento: El recocido, en genética, significa que secuencias complementarias de ADN o ARN monocatenario se emparejen por enlaces de hidrógeno para formar un polinucleótido bicatenario. El término se usa a menudo para describir la unión de una sonda de ADN, o la unión de un cebador a una cadena de ADN durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El término también se usa a menudo para describir la reforma (renaturalización) de hebras complementarias que fueron separadas por calor (desnaturalizadas térmicamente). Proteínas como RAD52 pueden ayudar a hibridar el ADN.