7.13G: Metagenómica

La metagenómica es el estudio de material genético derivado de muestras ambientales.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Resumir la utilidad de la metagenómica

Principales conclusiones

Puntos Clave

• Si bien los trabajos previos necesitaban el cultivo de microbios individuales antes de que pudieran ser secuenciados e identificados, la metagenómica intenta identificar de manera más completa muchos de los microbios que habitan una ubicación ambiental determinada.
• Los primeros intentos de metagenómica fueron secuenciar un gen de una muestra. Los cambios en ese gen ayudaron a determinar la diversidad microbiana en una muestra.
• La secuenciación de alto rendimiento permite la secuenciación completa y el ensamblaje de genomas completos de los microbios que habitan en un entorno dado, dando una profundidad sin precedentes en la comprensión de la diversidad microbiana del mundo que nos rodea.

Términos Clave

• solid: SoLiD (Sequencing by Oligation and Detection) es una tecnología de secuenciación de ADN de próxima generación desarrollada por Life Technologies y está disponible comercialmente desde 2008. Esta tecnología de próxima generación genera cientos de millones a miles de millones de lecturas de secuencia pequeña a la vez.
• gigabasa: mil millones de bases (nucleótidos) como unidad de longitud de un ácido nucleico
• pirosecuenciación: técnica utilizada para secuenciar ADN mediante reacciones enzimáticas quimioluminiscentes

Metagenómica

La metagenómica es el estudio de metagenomas; material genético recuperado directamente de muestras ambientales. El amplio campo también puede denominarse genómica ambiental, ecogenómica o genómica comunitaria. Mientras que la microbiología tradicional y la secuenciación del genoma microbiano y la genómica se basan en cultivos clonales cultivados, la secuenciación génica ambiental temprana clonó genes específicos (a menudo el gen ARNr 16S) para producir un perfil de diversidad en una muestra natural. Dicho trabajo reveló que la gran mayoría de la biodiversidad microbiana se había perdido por métodos basados en el cultivo. Estudios recientes utilizan secuenciación “escopeta” de Sanger o pirosecuenciación masiva paralela para obtener muestras en gran parte imparciales de todos los genes de todos los miembros de las comunidades muestreadas. Debido a su capacidad para revelar la diversidad previamente oculta de la vida microscópica, la metagenómica ofrece una lente poderosa para ver el mundo microbiano que tiene el potencial de revolucionar la comprensión de todo el mundo viviente.

Estudios de secuenciación convencional

La secuenciación convencional comienza con un cultivo de células idénticas como fuente de ADN. Sin embargo, estudios metagenómicos tempranos revelaron que probablemente hay grandes grupos de microorganismos en muchos ambientes que no pueden ser cultivados y por lo tanto no pueden ser secuenciados. Estos primeros estudios se centraron en secuencias de ARN ribosómico 16S que son relativamente cortas, a menudo conservadas dentro de una especie y generalmente diferentes entre especies. Se han encontrado muchas secuencias de ARNr 16S que no pertenecen a ninguna especie cultivada conocida, lo que indica que existen numerosos organismos no aislados. Estos estudios de genes de ARN ribosómico (ARNr) tomados directamente del ambiente revelaron que los métodos basados en el cultivo encuentran menos del 1% de las especies bacterianas y arqueales en una muestra.

Metagenómica de escopeta

Los avances en bioinformática, los refinamientos de la amplificación del ADN y la proliferación del poder computacional han ayudado en gran medida al análisis de secuencias de ADN recuperadas de muestras ambientales. Esto permite la adaptación de la secuenciación de escopeta a muestras metagenómicas. El enfoque, utilizado para secuenciar muchos microorganismos cultivados y el genoma humano, corta aleatoriamente el ADN, secuencia muchas secuencias cortas y las reconstruye en una secuencia consenso. La secuenciación de escopeta y las pantallas de bibliotecas de clones revelan genes presentes en muestras ambientales. Esto proporciona información tanto sobre qué organismos están presentes como qué procesos metabólicos son posibles en la comunidad. Esto puede ser útil para comprender la ecología de una comunidad, particularmente si se comparan múltiples muestras entre sí.

Figura: Secuenciación ambiental de escopeta (ESS): (A) muestreo del hábitat; (B) partículas filtrantes, típicamente por tamaño; (C) Lisis y extracción de ADN; (D) clonación y construcción de bibliotecas; (E) secuenciación de los clones; (F) ensamblaje de secuencias en cóntigos y andamios

La metagenómica de escopeta también es capaz de secuenciar genomas microbianos casi completos directamente del medio ambiente. Como la recolección de ADN de un ambiente es en gran parte incontrolada, los organismos más abundantes en una muestra ambiental están más altamente representados en los datos de la secuencia resultante. Para lograr la alta cobertura necesaria para resolver completamente los genomas de miembros de la comunidad subrepresentados, se necesitan grandes muestras. Por otro lado, la naturaleza aleatoria de la secuenciación de escopeta asegura que muchos de estos organismos, que de otro modo pasarían desapercibidos utilizando técnicas de cultivo tradicionales, estarán representados por al menos algunos pequeños segmentos de secuencia.

Secuenciación de Alto Rendimiento

Los primeros estudios metagenómicos realizados con secuenciación de alto rendimiento utilizaron pirosecuenciación 454 masivamente paralela. Otras dos tecnologías comúnmente aplicadas al muestreo ambiental son el Illumina Genome Analyzer II y el sistema Applied Biosystems SoLiD. Estas técnicas de secuenciación de ADN generan fragmentos más cortos que la secuenciación de Sanger; la pirosecuenciación 454 típicamente produce lecturas de ~400 pb, Illumina y SoLiD producen lecturas de 25-75 pb. Estas longitudes de lectura son significativamente más cortas que la longitud de lectura de secuenciación típica de Sanger de ~750 pb.

Sin embargo, esta limitación es compensada por el número mucho mayor de lecturas de secuencia. Los metagenomas pirosecuenciados generan entre 200 y 500 megabases, mientras que las plataformas Illumina generan alrededor de 20 a 50 gigabases. Una ventaja adicional de la secuenciación de lectura corta es que esta técnica no requiere clonar el ADN antes de la secuenciación, eliminando uno de los principales sesgos en el muestreo ambiental. Como la mayoría de los programas de ensamblaje de lectura corta no fueron diseñados para aplicaciones metagenómicas, se han desarrollado métodos especializados para utilizar datos de lectura mate en ensamblaje metagenómico. A partir de estos estudios se puede identificar de manera más precisa y eficiente la fauna microbiana que podría residir en una muestra de suelo, incluso en la superficie de un teclado.