7.13F: Secuenciación de ADN basada en didesoxinucleótidos de Sanger

Objetivos de aprendizaje

• Recordar la secuenciación de didesoxinucleótidos

La secuenciación de Sanger, también conocida como secuenciación de terminación de cadena, se refiere a un método de secuenciación de ADN desarrollado por Frederick Sanger en 1977. Este método se basa en la amplificación del fragmento de ADN a secuenciar por la ADN polimerasa y la incorporación de nucleótidos modificados —específicamente, didesoxinucleótidos (ddNTPs).

El método clásico de terminación de cadena requiere un molde de ADN monocatenario, un cebador de ADN, una ADN polimerasa, desoxinucleotidetrífosfatos normales (dNTP) y nucleótidos modificados (didesoxynTPS) que terminen la elongación de la cadena de ADN. Estos nucleótidos terminadores de cadena carecen de un grupo 3′-OH requerido para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que provoca que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP. Los ddNTPs pueden marcarse radioactiva o fluorescentemente para su detección en máquinas de secuenciación automatizadas.La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas, que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y la ADN polimerasa. A cada reacción se le agrega solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). Después de rondas de extensión de ADN molde desde el cebador unido, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan por tamaño usando electroforesis en gel. Esto se realiza frecuentemente usando un gel desnaturalizante de poliacrilamida-urea con cada una de las cuatro reacciones ejecutadas en uno de los cuatro carriles individuales (carriles A, T, G, C). Las bandas de ADN pueden entonces visualizarse por autorradiografía o luz UV y la secuencia de ADN puede leerse directamente de la película de rayos X o imagen de gel.

Figura: Secuenciación de Sanger: Diferentes tipos de secuenciación de Sanger, todas las cuales dependen de que la secuencia esté detenida por un didesoxinucleótidoterminador (barras negras).

Las variaciones técnicas de la secuenciación de terminación de cadena incluyen el etiquetado con nucleótidos que contienen fósforo radiactivo para el radiomarcaje, o el uso de un cebador marcado en el extremo 5' con un colorante fluorescente. La secuenciación de imprimadores de tinte facilita la lectura en un sistema óptico para un análisis y automatización más rápidos y económicos. El desarrollo posterior por Leroy Hood y sus compañeros de trabajo de ddNTPs y cebadores marcados fluorescentemente estableció el escenario para la secuenciación automatizada de ADN de alto rendimiento. Los métodos de terminación de cadena han simplificado enormemente la secuenciación del ADN. Más recientemente, se ha desarrollado la secuenciación de terminadores de tinte. La secuenciación con terminador de colorante utiliza el marcaje de los ddNTPs terminadores de cadena, lo que permite la secuenciación en una sola reacción, en lugar de cuatro reacciones como en el método de cebador marcado. En la secuenciación de terminadores de tinte, cada uno de los cuatro terminadores de cadena de didesoxinucleótidos está marcado con tintes fluorescentes, cada uno de los cuales emite luz a diferentes longitudes de onda.

Figura: Cromatógrafo: Este es un ejemplo de la salida de una lectura de secuenciación de Sanger usando terminadores de colorante marcados fluorescentemente. Las cuatro bases de ADN están representadas por diferentes colores los cuales son interpretados por el software para dar la secuencia de ADN anterior.

Los instrumentos automatizados de secuenciación de ADN (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar hasta 384 muestras de ADN en un solo lote (serie) en hasta 24 ejecuciones al día. Los secuenciadores de ADN llevan a cabo electroforesis capilar para separación por tamaños, detección y registro de fluorescencia del colorante, y salida de datos como cromatogramas de trazas de picos fluorescentes. La automatización ha llevado a la secuenciación de genomas completos.

Puntos Clave

• La falta del segundo grupo desoxilo en un dNTP convirtiéndolo en ddNTP, detiene la incorporación de más nucleótidos, esta terminación crea longitudes de ADN detenidas en cada nucleótido, esto es central para identificar aún más cada nucleótido.
• Se pueden usar diferentes marcadores, los ddNTPs, los dNTPs y los cebadores se pueden marcar con radiactividad y fluorescentemente.
• Usando marcadores fluorescentes, la secuenciación didesoxídica puede automatizarse permitiendo métodos de alto rendimiento que se han utilizado para secuenciar genomas completos.

Términos Clave

• Cromatograma: La salida visual de un cromatógrafo. Por lo general, una pantalla gráfica o histograma.
• didesoxinucleótidos: Cualquier nucleótido formado a partir de un desoxinucleótidos por pérdida de un segundo grupo hidroxi del grupo desoxirribosa