7.25B: Secuenciación de ADN de Sitios de Inserción

Un sitio de inserción es la posición en la que se integra un elemento genético transponible.

Objetivos de aprendizaje

• Discutir los usos de los sitios de inserción de secuenciación

Puntos Clave

• Existen varios métodos para analizar secuencias de inserción, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa inversa. La PCR inversa implica una serie de digestiones de restricción y ligación, dando como resultado un fragmento en bucle que puede cebarse para PCR a partir de una sola sección de secuencia conocida.
• El producto amplificado puede entonces secuenciarse y compararse con bases de datos de ADN para localizar la secuencia que ha sido alterada.
• Otras técnicas incluyen hibridación Southern y modificaciones del protocolo PCR.

Términos Clave

• transposones: Un segmento de ADN que puede moverse a una posición diferente dentro de un genoma.

Una secuencia de inserción (también conocida como IS, un elemento de secuencia de inserción o un elemento IS) es una secuencia de ADN corta que actúa como un elemento transponible simple.

Las secuencias de inserción tienen dos características principales: son pequeñas en relación con otros elementos transponibles (generalmente alrededor de 700 a 2500 pb de longitud) y solo codifican proteínas implicadas en la actividad de transposición (por lo tanto, son diferentes de otros transposones, que también portan genes accesorios como genes de resistencia a antibióticos).

Estas proteínas suelen ser la transposasa que cataliza la reacción enzimática permitiendo que el IS se mueva, y también una proteína reguladora que estimula o inhibe la actividad de transposición. La región codificante en una secuencia de inserción suele estar flanqueada por repeticiones invertidas. Por ejemplo, el conocido IS911 (1250 pb) está flanqueado por dos extremidades repetidas invertidas de 36 pb y la región codificante tiene dos genes parcialmente solapados orfA y orfAB, codificando la transposasa (orFab) y una proteína reguladora (OrfA).

Una secuencia de inserción particular puede nombrarse de acuerdo con la forma ISn, donde n es un número (por ejemplo, IS1, IS2, IS3, IS10, IS50, IS911, IS26, etc.); sin embargo, este no es el único esquema de nomenclatura utilizado. Aunque las secuencias de inserción generalmente se discuten en el contexto de genomas procariotas, ciertas secuencias de ADN eucariotas que pertenecen a la familia de elementos transponibles TC1/Mariner pueden considerarse secuencias de inserción.

Figura: Naegleria fowleri: Detección de anticuerpos (verde) de Naegleria fowleri, el organismo responsable de la meningoencefalitis amebiana primaria (PAM).

Además de ocurrir de manera autónoma, las secuencias de inserción también pueden ocurrir como partes de transposones compuestos; en un transposón compuesto, dos secuencias de inserción flanquean uno o más genes accesorios, tales como un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, Tn10, Tn5). Sin embargo, existe otro tipo de transposones, llamados transposones unitarios, que no portan secuencias de inserción en sus extremidades (por ejemplo, Tn7). Un transposón complejo no se basa en secuencias de inserción flanqueantes para la resolvasa. La resolvasa es parte del genoma de tns y corta en repeticiones invertidas flanqueantes.

Aunque hay varios métodos disponibles para localizar ISs en genomas microbianos, son intensivos en mano de obra o ineficientes. Estos incluyen hibridación Southern, reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR) y, más recientemente, PCR de vectorette para identificar y mapear las posiciones genómicas de las secuencias de inserción.

La hibridación Southern consume bastante tiempo y requiere procedimientos adicionales para localizar las ISs. La PCR inversa, un método de PCR comúnmente utilizado para recuperar secuencias flanqueantes desconocidas de una secuencia diana conocida, utiliza una biblioteca de fragmentos circularizados de ADN cromosómico como molde y dos cebadores externos ubicados en cada extremo del fragmento conocido para la amplificación. Sin embargo, cuando una secuencia diana tiene múltiples ubicaciones genómicas, los círculos de ADN de diversos tamaños formados son difíciles de amplificar simultáneamente. Además, la longitud de cada fragmento de ADN de restricción que contiene una secuencia diana debe determinarse mediante hibridación Southern seguida de fraccionamiento subgenómico antes de la ligación intramolecular y amplificación por PCR. Estas dificultades hacen que la hibridación Southern y la iPCR sean poco prácticas como técnicas para la prospección rápida de elementos repetitivos en genomas.

La PCR de vectorette (vPCR) es otro método utilizado para amplificar secuencias desconocidas que flanquean un fragmento de ADN caracterizado. Implica cortar ADN genómicos con una enzima de restricción, ligar vectorettes a los extremos y amplificar las secuencias flanqueantes de una secuencia conocida usando cebadores derivados de la secuencia conocida junto con un cebador de vectorette.

Figura: PCR inversa: Resumen del proceso de iPCR