7.25C: Northern Blots

Las transferencias Northern permiten a los investigadores determinar el peso molecular del ARN mensajero y el contenido de la muestra.

Objetivos de aprendizaje

• Evaluar las aplicaciones de Northern Blots

Puntos Clave

• El ARN (ya sea ARN total o solo ARNm) se separa por electroforesis en gel, generalmente un gel de agarosa. Debido a que hay tantas moléculas de ARN diferentes en el gel, suele aparecer como un frotis en lugar de bandas discretas.
• El ARN se transfiere a una hoja de papel secante especial llamada nitrocelulosa, aunque se pueden usar otros tipos de papel, o membranas. Las moléculas de ARN conservan el mismo patrón de separación que tenían en el gel.
• La transferencia se incuba con una sonda que es ADN monocatenario. Esta sonda formará pares de bases con su secuencia de ARN complementaria y se unirá para formar una molécula de ARN-ADN bicatenario. La sonda es radiactiva o tiene una enzima unida a ella.

Términos Clave

• hibridación: El acto de hibridar, o el estado de ser hibridado.

La transferencia Northern es una técnica utilizada en la investigación de biología molecular para estudiar la expresión génica en una muestra, a través de la detección de ARN (o ARN mensajero aislado). Con Northern blotting es posible observar el control celular sobre la estructura y función determinando los niveles particulares de expresión génica durante la diferenciación, morfogénesis, así como condiciones anormales o enfermas. La transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección con una sonda de hibridación complementaria a parte o a la secuencia diana completa.

Figura: Técnica de transferencia Northern: Diagrama de flujo que describe el procedimiento general para la detección de ARN por transferencia Northern.

El término 'Northern blot' en realidad se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, todo el proceso se conoce comúnmente como transferencia Northern. La técnica northern blot fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford. Northern blotting toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, la Southern blot, llamada así por el biólogo Edwin Southern. La principal diferencia es que el ARN, más que el ADN, se analiza en la transferencia Northern.

Un procedimiento general de transferencia comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizado o de células. El ARNm eucariota puede entonces aislarse mediante el uso de cromatografía de oligo (dT) celulosa para aislar solo aquellos ARN con una cola poli (A). A continuación, las muestras de ARN se separan mediante electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas son incapaces de ingresar a la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nylon a través de un sistema capilar o de transferencia al vacío.