7.25I: Análisis de unión al ADN del genoma completo

El análisis de unión al ADN del genoma completo es una herramienta poderosa para analizar modificaciones epigenéticas y secuencias de ADN unidas a proteínas reguladoras.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Describir el análisis de unión al ADN del genoma completo

COMIDA PARA LLEVAR CLAVE

Puntos Clave

• El análisis de unión al ADN del genoma completo, también conocido como análisis de ubicación, utiliza inmunoprecipitación de cromatina y chip de micromatriz.
• El análisis de unión al ADN del genoma completo utiliza el método Chip-on-Chip. Brevemente, los complejos proteína-ADN se reticulan, inmunoprecipitan, purifican, amplifican y marcan, y luego se dejan hibridar con una variedad de matrices de alta resolución.
• Esta técnica es una identificación y análisis de alto rendimiento (en todo el genoma) de fragmentos de ADN unidos por proteínas específicas como histonas y factores transcripcionales.

Términos Clave

• inmunoprecipitación: Técnica en la que un antígeno se precipita de una solución mediante el uso de un anticuerpo, o un uso particular de esta técnica.

Las secuencias de ADN genómico se están determinando a un ritmo cada vez más rápido. Esto ha creado la necesidad de técnicas más eficientes para determinar qué partes de estas secuencias están unidas in vivo por los procesos de control de proteínas; como la expresión génica, la replicación del ADN y la mecánica cromosómica.

Se estableció un enfoque de genoma completo para identificar y caracterizar dichas secuencias de ADN. El método de inmunoprecipitación de cromatina, combinado con microarrays (Chip-chip), es una poderosa herramienta para el análisis genómico de la unión a proteínas. También se ha convertido en un método ampliamente utilizado para la localización en todo el genoma de las interacciones proteína-ADN.

El primer paso en el procedimiento Chip-chip es fijar las interacciones proteína-ADN en células vivas mediante reticulación química. El reticulante debe ser pequeño para difundirse rápidamente en las células. En la práctica, el formaldehído se usa en la mayoría de los experimentos Chip-chip. Después de la lisis celular, el ADN se fragmenta por sonicación. Este extracto se somete luego a inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo específico contra la proteína de interés.

El ADN unido por la proteína será coprecipitado y enriquecido, en comparación con el ADN no unido por la proteína respectiva. Para facilitar la inmunoprecipitación y posterior lavado, los anticuerpos generalmente se acoplan a perlas de agarosa o magnéticas a través de proteína A o G. Después de la reversión de la reticulación, el ADN se purifica mediante extracción con fenol o kits de limpieza comerciales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

A menudo, se incluye una etapa de amplificación después de la purificación del ADN. Se utilizan dos marcadores de fluorescencia diferentes para marcar el ADN IP y un ADN de control de hibridación, respectivamente. Por lo general, el ADN total antes de IP (ADN de entrada) se usa como control de hibridación.

Los dos ADN marcados diferencialmente se hibridan con la misma micromatriz y la diferencia en la intensidad de fluorescencia da una medida del enriquecimiento.

Figura: Procedimiento Chip-chip: Flujo de trabajo Chip-chip realizado en laboratorio